发明背景
核苷酸经核苷酸还原酶(RR)还原转化为脱氧核苷酸，是DNA生物合 成途径中的关键控速步骤(Cory，J.g.“核苷酸二磷酸还原酶活性的抑制剂”， InternationalEncyclopediaofPharmacology和Therapeutics，Cory，J.G.；Cory， A.H.编辑；Pergamon出版社；纽约，(1989)；128章节，1-16页)。由于脱 氧核苷酸在哺乳动物细胞中的水平非常低，肿瘤生长速度与核苷酸还原酶 比活性之间表现出良好的相关性(Elford，等，J.Biol.Chem.(1970)，245， 5228)。哺乳动物的核苷酸还原酶由两种不同的蛋白质组成，即与核苷酸底 物结合的R1，和含有非血红素铁和游离酪氨酰基的R2(ReichardP. Ehrenberg，A.Science，(1983)，221，514)。R1和R2对酶活性均有影响。
目前，存在两大类RR抑制剂。第一类包括核苷类似物，其作用机制 涉及与酶的R亚单位结合；其中的一些抑制剂正在进入临床开发中。在这 些抑制剂中，2′，2′-二氟-2′-脱氧胞苷(吉西他滨(Gemcitabine)，商品名： Gemzar，Elililly公司)最近经美国食品与药物管理局批准用于治疗胰腺癌 (Baker，等，J.Med.Chem.(1991)，34，1879)，和2′-氟化亚甲基-2′-脱氧胞苷 正处于有关治疗各种肿瘤的临床试验评价中(McCarthy，J.R.和Sunkara，P.S. 核苷酸还原酶抑制剂的设计、合成和抗癌活性，Weiner，D.B.；Williams，W.V. 编辑.；CRC出版社，BocaRaton，(1994)，681364)。第二类RR抑制剂包括 N-羟基脲(Reichard和Ehrenberg，Science，(1983)，221，514和Wright等， CellBiol.(1990)，68，1364)以及HCTs[N-杂环醛缩氨硫脲]，它通过破坏R2 亚单位的自由基而起作用。业已证明HCTs是核苷酸还原酶的最有效抑制 剂酶，在体外比N-羟基脲强80-5000倍(参见Liu等，J.Med.Chem.(1992)， 35，3672和J.Med.Chem.Science，(1995)38，4234)。
目前公认的是，HCTs可通过其与R2亚单位上铁的高度亲合性，而发 挥其酶抑制作用，因为铁是核苷酸还原酶活性位点上的必需元素。多年前， 对该系统中的先导化合物5-HP进行了I期临床评价(DeConti，等，Cancer Res.(1972)，32，1455和Moore，等，CancerRes.(1971)，31，235)，结果表 明该化合物在动物模型中良好的活性，但是在患有实体瘤的病人中却没有 活性，这大概是与其在人体内的快速代谢有关。通过引入空间位阻和用氨 基部分取代羟基，对5-HP进行了修饰，可得到一系列含有3-氨基-的化合 物(例如，1A(3-AP)和1B(3-AMP)(参见下面))。在这些抑制剂中，3-AP表现 出优秀的抗癌活性(Liu等，J.Med.Chem.(1992)，35，3672)和显著降低的清 除率(clearancerate)。它目前处于1期临床试验中。当药物达到药动学终点 而没显示出任何药物相关的毒性时，即可停止单一剂量临床试验。有关长 期(extended)给药方案(每日5次，96小时连续的输注)的附加1期研究正在 进行中。
1AR＝H3-AP(TriapineTM)
1BR＝CH33-AMP
尽管3-AP显示出了体内活性，但是该化合物的治疗潜力可能因其较差 的水溶性而受到限制。因此，为了改善其水溶性和治疗指数，开发出了两 种含磷酸盐的水溶性前药2(对位3-AP前药)和3(邻位3-AP前药)。含磷酸 盐的前药是用来使化合物在中性pH下具有优良的水溶性，并提高其生物利 用度。
对3-AP前药进行的初步体外评价表明，它们可迅速地被碱性磷酸酶酶 转化成3-AP。但是，在Beagle犬的体内PK研究表明，从含邻位磷酸盐3 中释放出来的3-AP的半衰期为14.2小时，而对位前药2的半衰期仅为1.5 小时。同时，还在荷M-109实体瘤的小鼠体内，对前药2和3进行了评价(与 3-AP和环磷酰胺比较)。这些实验的结果表明，与母体3-AP相比，邻位前 药3降低毒性的效力更高，并且其活性与环磷酰胺(cytoxan)相当。为了进 一步改进3-AP前药的生物学和药物特性，并使其治疗应用最佳化，设计了 一系列含邻位磷酸盐的前药。
2对位3-AP前药3邻位3-AP前药
发明目的
在本发明的一个方面，本发明的一个目的是用于治疗瘤形成 (neoplasia)(包括癌症)患者的化合物、药物组合物和方法。
在本发明的另一方面，本发明的一个目的是提供采用特定组合物治疗 瘤形成的方法，所述组合物在活性、药动学、生物利用度和降低毒性方面 表现出具有良好且增强的特性。
本发明另一目的提供用于治疗癌症的组合物和方法，所述癌症对传统 化疗剂治疗有抗性。
通过下面的本发明说明书，可容易地发现本发明的一个或多个这些目 的以及其它目的。
发明概述
本发明涉及具有以下结构化合物：
其中R是H或CH3；
R2是磷酸或其盐的形式；
R3是H、F、Cl、Br、I、OCH3、OCF3、CF3或C1-C3烷基；
R4为H、F、Cl、Br、I、OCH3、OCF3、CF3、NO2、CN、SO2CF3、COOCH3、 SF5、SO2CH3、COCH3、NH2、N(CH3)2、SCH3、OH；和
R5和R6相互独立地为H、F、Cl、Br、I、OCH3、OCF3、CF3、NO2、 CN、SO2CF3、COOCH3、SF5、SO2CH3、COCH3、NH2、N(CH3)2、SCH3或 OH，
其条件是：R3、R4、R5或R6中的至少1个不是H，并且当R3、R4、R5 或R6中任意2个不是H时，R3、R4、R5或R6中的另2个是H。
在上述本发明的化合物中，优选地，当R3、R4、R5或R6中任意2个不 是H时，R3、R4、R5或R6中的另2个是H。
在上述本发明的化合物中，优选地，其中R3、R4、R5或者R6中的两个 不是H，而选自F、Cl、Br或I。
在尤其优选的本发明化合物中，当R3、R5、R6是H时，R4是Cl、F或 Br(优选为Cl)。在其它优选的本发明化合物中，当R3、R4、R6是H时，R5 是F、Cl、OCH3或OCF3(优选为F)。在本发明优选的其它化合物中，当R3、 R4、R5或R6中的2个选自F、Cl、Br、或I(优选两取代基相同，更优选两取 代基是Cl)时，R3、R4、R5或R6中的另2个是H。在其它优选的本发明化合 物中，当R4和R5或R5和R6均为F或Cl(优选均为Cl)时，另一R3和R6或 R3和R4均是H。在此所述的本发明化合物和尤其优选的组合物，是能非常 有效治疗瘤形成包括癌症的化合物，与对位或邻位3-AP前药2和3相比， 具有至少一种或更多显著增强的抗瘤形成活性、显著提高的最大耐受剂量 (MTD)和降低的毒性，以及延长的半衰期和有利的药动学。这些结果是出乎 意料的。这样，可施用更高剂量的本发明优选化合物，从而获得更大的抗瘤 形成(包括癌)效力，并表现出延长的血流半衰期和降低的毒性。
本发明化合物可用于具有生物学/药理学活性的药物组合物中，所述组 合物可用于治疗例如瘤形成(癌症)以及许多其它病症和/或疾病状态，所述化 合物还可用作合成生物活性化合物的中间体，以及用作确定本发明化合物以 及其它生物学活性物质生物活性的标准品。在某些应用中，本发明化合物可 用来治疗微生物感染、尤其包括病毒感染。这些组合物包含有效量的任何一 种或更多上述公开化合物，任选与可药用添加剂、载体或赋形剂结合。
本发明的另一方面涉及治疗瘤形成(包括癌症)，其中包括将有效量的上 述化合物给予需要这种治疗的病人，所述化合物任选与可药用添加剂、载体 或赋形剂结合。本发明还涉及用于抑制瘤形成(包括恶性肿瘤或癌症)生长的 方法，包括将抑制或治疗有效量或浓度的至少一种上述化合物与瘤形成接触。 这些方法治疗性用于治疗瘤形成(包括癌症)，也可用于比较试验，例如用于 确定有关类似物活性的分析，以及用于确定患者癌症对一种或更多本发明敏 感性的分析试验。所述化合物的主要应用是治疗瘤形成，包括癌，尤其包括 肺癌、乳腺癌和前列腺癌等。
本发明还涉及本发明的化合物在制备用于治疗瘤形成的药物中的应用。
本发明还提供一种治疗瘤形成的方法，包括将有效量的本发明的化合物 和DNA损伤性抗癌药联合给予需要这种治疗的患者。
本发明还涉及本发明的化合物和DNA损伤性抗癌药在制备用于治疗瘤 形成的药物中的应用。
附图简述
附图1代表本发明某些化学物。
附图2-3代表本发明化合物的化学合成路线。
附图4-15是本发明优选实施方案化合物的效力、药动学、生物利用度、 联合化学疗法和毒性的试验结果。
发明详述
在本发明上下文中使用了以下术语。
在本说明书中，术语“患者”是指采用本发明组合物进行治疗(包括预防 性治疗)的动物(包括哺乳动物和优选为人)。在治疗某种动物(例如人)患者特 异性的感染、病症或疾病状态时，所述“患者”是指这种特定动物。
在本说明书中，术语“有效量”是指足以使所治疗疾病或病症产生有利变 化的本发明化合物浓度或用量。根据所治疗或病症的不同，所述变化包括： 癌症或肿瘤生长或尺寸的缓解、下降，有利的生理结果，以及微生物的生长 或分解(elaboration)的减少等。
在本说明书中，术语“烷基”是指包含1-3个碳单位的烷基。本发明中的 烷基包括线性或支链基团，例如甲基、乙基、丙基和异丙基。
术语“盐类”是指涉及本发明化合物应用的任何盐。在所述化合物用于药 物适应症(包括治疗瘤形成，包括癌症)的情况下，术语“盐类”表示可用作药 物的化合物的可药用盐。
术语“瘤形成”是指导致赘生物形成和生长的病理过程，即由细胞增殖产 生的异常组织生长，该组织的生长比正常组织快，并在引起新生体的刺激源 停止后仍能继续生长。瘤形成表现为部分或完全缺乏结构组织以及与正常组 织的机能协调性，通常会形成明显组织肿块，它可能是良性的(良性肿瘤)或 恶性的(癌)。术语“癌症”是用来描述任何各种类型恶性肿瘤的通称，其中的 大多数会侵袭周围组织，能转移至若干部位，并可能在设法切除后复发，如 果得不到充分治疗，可导致患者死亡。在此所用的术语癌症包括在“瘤形成” 内。
本发明优选的治疗方面涉及用于动物或人患者的瘤形成(包括良性的和 恶性肿瘤和癌)的方法，在优选实施方案中，所述癌具有发展的耐药性，例 如多药耐药乳腺癌，该方法包括施用治疗有效量或浓度的一种或更多化合 物，以抑制所治疗动物或人患者的瘤形成的生长或传播，或者使瘤形成事实 上萎缩。
例如，可采用本发明组合物治疗的癌包括：胃、结肠、直肠、肝脏、胰 腺、肺、乳房、子宫颈、子宫体、卵巢、前列腺、睾丸、膀胱、肾、脑/中枢 神经系统、头和颈部、咽喉、何杰金氏病(Hodgkinsdisease)、非何杰金氏白 血病、多发性骨髓瘤白血病、皮肤黑素瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性粒 细胞白血病、尤因氏肉瘤、小细胞肺癌、绒毛膜癌、横纹肌肉瘤、肾胚细胞 瘤、成神经细胞瘤、毛细胞白血病、口/咽、食管、喉、黑素瘤、肾和淋巴瘤 等。本发明化合物尤其可用于治疗肺癌、乳腺癌和前列腺癌。
在本发明方法中，在某些优选实施方案中，发现与至少另外一种抗肿瘤 药物联用，对于瘤形成(包括癌)的治疗是有利的。在本发明的这些方面中， 可将有效量的一种或更多本发明化合物与有效量的至少另外一种抗肿瘤药 物/抗癌剂联用，所述另外的抗肿瘤药物/抗癌剂例如：环磷酰胺 (cylophosphamide)，丝裂霉素C和依托泊苷等，包括topoI和topoII抑制剂， 例如阿霉素、拓扑替康和依立替康(irinotecan)，其他药物例如吉西他滨 (gemcitabine)，喜树碱(campothecin)和以喜树碱为基础的药物，和顺铂等，烷 基化剂包括苯丁酸氮芥(chlorambucil)和美法仑(苯丙氨酸氮芥，melphalan)。 出人意料地发现，通过减少或防止DNA修复的机制而起作用的本发明化合 物(即R3、R4、R5和R6为H的化合物)，可与损害DNA的化合物协同作用。 这样，本发明化合物可有利地与通过损害DNA而起作用的任一化合物联用， 其中后者尤其包括烷基化剂和铂化(platinating)剂。所谓“联用”是指施用本发 明化合物后，不管联用的化合物是否同时施用，均可在患者血流中同时发现 本发明化合物以及联用的化合物。在许多情况下，本发明化合物与传统抗癌 剂的联用可产生协同作用(即大于加合作用)该结果是出人意料的。
以本发明新颖化合物为基础的药物组合物可用于治疗病症或疾病例如 瘤形成(包括癌)，其中包括任选与药用添加剂、载体或赋形剂结合的治疗有 效量的上述化合物。
药物剂型中的很多化合物可用作预防某种疾病或病症的预防剂。
可以其药用盐类的形式提供本发明化合物或其衍生物。在此所用的术 语“药用盐类或络合物”是指适当的盐类或本发明活性化合物的络合物 (complex)，它们保持了母体化合物的所需生物活性，并对正常细胞表现出 有限的毒理学作用。这种盐类的非限定性示例包括磷酸钠盐和钾盐等。对 所述活性化合物的修饰可改变化学物质的溶解性、生物利用度和新陈代谢 速度，这样可实现对化学物质传递的控制。另外，修饰可以影响所述化合 物的抗癌活性(有时候会强于母体化合物)。本领域技术人员采用常规方法， 可容易地制备并测试评价所述衍生物的抗癌活性。
可将本发明化合物掺入适于所有途径施用的制剂中，这例如包括：经 口和非肠道，包括静脉内、肌内、腹膜内、颊内、经皮和栓剂形式。其中 优选非肠道给药，尤其优选静脉内或肌内施用。
以这些新颖化合物为基础的药物组合物包括用于治疗瘤形成、癌及其 他疾病和病症的治疗有效量的上述化合物，任选与药用添加剂、载体和/或 赋形剂结合。本领域技术人员可以理解的是，根据欲治疗的感染或病症、 采用的治疗方案、所用药物的药动学以及所治疗的患者(动物或人)，可对一 种或更多本发明化合物的治疗有效量加以调整。
在本发明的制药方面，优选以本发明化合物与药用载体混合的形式配 制。通常，优选经非肠道施用所述药物组合物，尤其优选以静脉内肌内剂 型施用，但是许多制剂也可经其它非肠道途径施用，例如经皮、颊、皮下、 栓剂或其它途径包括经口施用。优选以无菌盐水施用静脉内和肌内制剂。 当然，在本发明的教导下，在不降低本发明组合物稳定性和不损害其治疗 活性的情况下，本领域技术人员可对制剂加以改进，以提供用于特定给药 途径的多种制剂。具体地说，例如采用本领域普通技术人员熟知的较小修 饰(例如成盐等)，即可容易地实现对本发明化合物的修饰，从而可改善它们 在水或其它载体中的溶解度。为了对本发明化合物的药动学加以控制，使 之对患者产生最大有利的效力，本领域技术人员可改进特定化合物的给药 途径和给药方案。
本领域技术人员可利用本发明前药形式化合物有利的药动学参数，从 而将本发明化合物有利传递至宿主生物体或患者体内的目标位点，使化合 物的预期效果最大化。
本发明治疗活性制剂中的化合物用量是可用于治疗感染或病症的有效 量。在优选实施方案中，本发明化合物、尤其是当R4是Cl或R5是F、Cl、 OCH3或OCF3和苯环(不是磷酸盐和氨基甲酸乙酯部分)上的剩余取代基是 H时，所述化合物优选用于治疗瘤形成和尤其癌症(在某些情况下包括耐药 性癌症)。通常，剂型中本发明优选化合物的治疗有效量约0.025mg/kg- 2.5mg/kg，优选约2.5-5mg/kg-100mg/kg患者体重，更优选约20-50mg/kg， 更优选约25mg/kg，这些剂量范围可能用于本发明，但应根据所用的具体 化合物、所治疗的病症或感染和给药途径来调节治疗有效量。至于上述的 本发明优选组合物，即R4是Cl或R5是F、Cl、OCH3或OCF3和苯(不是磷 酸盐和氨基甲酸乙酯部分)上的剩余取代基是H时的化合物，由于其增强的 抗癌活性，同时对非癌性寄主细胞的总毒性降低以及较高的生物利用度， 可采用高于triapine1A3-10倍的水平施用这些化合物，而且具有明显较低 的毒性。在这些剂量水平时，从前药形式中处释放出来的triapine的AUC(曲 线下面积)约是以非前药形式使用的triapine的5-25倍。因此，本发明化合 物表现出意料不到的结果，并且是用于治疗瘤形成尤其癌症的杰出药物。 通常，上述列举的剂量范围可产生有效的活性物质血液水平，即在患者血 液中的浓度约低于0.04-400μg/cc或更高。与先有技术TriapineTM相比(克分 子水平)，本发明化合物具有更有利的生物利用度特性，以及降低的毒性和 更大的活性，本发明化合物可用作治疗瘤形成(包括癌症)的出人意料的有利 化合物。
可连续施用(静脉滴注)本发明活性物质，这包括经推注 (bolusadministration)，静脉内或肌内，次数少于每天施用一次至几次，还包 括经局部、非肠道、肌内、静脉内、皮下、经皮(包括穿透促进剂)、经颊和 栓剂施用，以及在某些情况下经其它给药途径包括口服施用。
为了制备本发明药物组合物，优选采用常规制药混合技术，将治疗有 效量的一种或更多本发明化合物与可药用载体紧密混合，制得制剂。可根 据预期的施用(例如静脉内或肌内)制剂形式而选择各种载体。在制备适当剂 型形式的药物组合物时，可采用任何常规的制药介质。对于非肠道制剂， 所述载体通常包括无菌水或水性氯化钠溶液，也可包括有助于分散的其它 成分。当然，尽管采用了无菌水和无菌操作，组合物和载体仍须灭菌。还 可采用液体载体、助悬剂等，配制注射用混悬剂。
本发明化合物可用于治疗动物患者和尤其是哺乳动物包括人。这样， 可施用有效量一种或更多本发明化合物或其衍生物或可药用盐，来治疗患 有肿瘤和尤其癌症或在此公开的其它疾病的人、马(equines)、犬、牛及其他 动物，和尤其哺乳动物，其中本发明化合物任选与可药用或稀释剂混合， 可单独使用本发明化合物或者根据所治疗的疾病而与其它已知药物联用。 这些治疗也可与其它常规癌症疗法例如放射治疗或外科手术结合。
可药用载体或稀释剂中的活性物质，其用量应足以向患者传递预期适 应症所需的治疗有效量药物，同时不对所治疗患者产生严重毒性作用。
可以任何适当的单位剂型方便地施用化合物，包括但不限于每单位量 含有1-3000mg、优选5-500mg活性成分的剂型。
药物组合物中活性物质的浓度将取决于所述药物的吸收、分布、灭活 和排泄率，以及本领域技术人员熟知的那些因素。应当注意的是，剂量应 随着所述病症的减轻而变化。可以理解的是，任何特定的受试者，应根据 个体需要以及负责给药指导施用组合物的专业人员的判断，随时调整具体 的给药方案，而且在此所述的浓度范围仅是示例性，对权利要求组合物的 范围或应用没有限制。可立即施用活性成分，或分成多个较小剂量在不同 间隔内施用。
本发明活性物质也可与不损害本发明活性物质所需作用的其他活性物 质组合，或者与增强所需作用的活性物(例如其它抗癌剂)组合，在某些情况 下，根据所需的疗法或目标，可与抗生素、抗真菌剂、抗炎剂或抗病毒化 合物等组合。
可采用包括以下组分供非肠道、真皮内、皮下、或局部施用的溶液剂 或混悬剂：无菌稀释剂例如注射用水、盐溶液、不挥发性油(fixedoils)、聚 乙二醇、甘油、丙二醇、或其它合成溶剂；抗菌剂例如苯甲醇或尼泊金甲 酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸 (EDTA)；缓冲剂例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和等张调节剂例如氯化钠 或右旋糖。非肠道给药制剂可装入安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料多剂 量小瓶中。如果供静脉内施用，优选的载体包括例如生理盐水或磷酸盐缓 冲盐水(PBS)。
在一个实施方案中，可采用防止化合物从体内快速消除的载体配制活 性物质，例如制成控释制剂包括植入剂和微囊化的给药系统。可采用生物 降解的生物相容聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚酐、聚羟基乙酸、 胶原、聚原酸酯和聚乳酸。对本领域技术人员而言，制备这类制剂的方法 是显而易见的。
也可采用脂质体混悬液作为药用载体。可按照本领域技术人员熟知的 方法配制这些制剂。例如，可将适当的脂质溶于无机溶剂中，然后蒸发溶 剂，在容器表面上留下干燥脂质膜，从而制得脂质体制剂。然后将活性物 质的水溶液引入容器中。然后用手旋动容器，使类脂材料从容器壁上剥落 下来，并分散成类脂聚集物，从而形成脂质体混悬液。本领域普通技术人 员已知的其它制备方法也可用于本发明的这些方面中。
可采用本领域技术人员已使用和公认的各种生物学分析方法评价化合 物的抗癌活性。任一种这些方法均可用于评价在此公开化合物的活性。
一种用于评价活性的常规方法是采用癌细胞系的试验小组。这些试验 可体外评价特定化合物在癌细胞系中的抗癌活性，并为体内应用所述待试 化合物提供参考数据。其它分析包括体内评价化合物对人或适当动物模型 的作用，例如使用植入或移植到小鼠或其它适当动物模型中的小鼠肿瘤细 胞。
化学合成
对3-AP前药进行的初步体外评价表明，它们可迅速经碱性磷酸酶酶转 化成3-AP。与之相反的是，在Beagle犬的体内PK研究表明，从含邻位磷 酸盐前药中释放出来的3-AP的半衰期仅为14.2小时，而对位前药的半衰 期仅为1.5小时。同时，在荷M-109实体瘤的小鼠体内，对前药2和3进 行了评价(与抗3-AP和环磷酰胺比较)。这些实验的结果表明，与母体3- AP(1A)相比，邻位前药3降低毒性的效力更高，并且其活性与环磷酰胺相 当。为了进一步改善3-AP前药的生物学和药物特性，并使其治疗应用最佳 化，采用以下原理，设计了一系列以邻位磷酸盐为基础的前药。
用于设计新的前药的原理是：3-AP磷酸盐连接的前药经脱磷酸作用释 放3-AP而得到4，和随后经苄基碎裂(fragmentation)，得到可用作生物学烷 基化剂的醌的甲基化物(quinonemethide)5。
期望不受理论所限，据推测该前药活化过程中的控速步骤可能是P-O键断裂步骤(碱性磷酸酶催化)。随后的碎裂步骤通常较快。这可能是由于3- AP前药具有较长的循环半衰期，使其起到3-AP贮库的作用，或者是因为 前药的分布不同于母体药物，可能使其具有所需的性能。达到该目的方法 是使脱磷酸作用步骤减慢，通过在α位向磷酸基引入庞大的取代基，使含 3-AP磷酸盐前药的生物活化中的这一限速步骤减慢。这些烷基通过接近P-O键裂位点而产生了空间位阻作用，从而使酶促脱磷酸作用减速。另一方 法在苯基环中引入能影响P-O键裂速度的释电子或吸电子基团。同样地， 在其它位置上用释电子和吸电子基团进行取代，可影响随后的碎裂步骤。
基于这些考虑，可方便地大量合成了许多磷酸盐的前药(附图1)，并进 行了评价。这些前药的二钠盐在水中极易溶解。
5-氯代前药化合物6的合成如附图2所示。这样，例如采用2-氯代3- 烟酸甲酯18或衍生物，经两步制得酸20，所述两个步骤包括Heck反应(参 见Jeffery，Tetrahedron(1996)，52，10113和Dieck和Heck，J.Org. Chem.(1975)，40，1083)和NaOH促进的酯水解。通过双-TMSE亚磷酸盐与 2-羟基苄醇之间的氧化偶合(McCombie等，J.Chem.Soc.(1945)，381)，制 得氯代邻位磷酸盐接头(linker)21。大规模制备接头21遇到问题是其在纯化 期间会分解，这使产率降低。用Et3N为缓冲剂以中和硅胶的酸性，调节所 述条件，从而可大量获得接头(88％)。在Curtius重排条件下(Shipps等， J.Bioorg.Med.Chvem.(1996)，4，655)，加热含有酸20、接头21、三乙胺和二 苯基磷酰叠氮化物的反应混合物，提供所需的氨基甲酸盐22(58％)，它接着 转化为醛23(72％)和相应的缩氨基硫脲(thio-semicarbazone)24(产率63％)。 用TFA除去24中的2-三甲基甲硅烷基乙基(TMSE)基团(Chao等，J. Org.Chem.(1994)，59，6687)，提供3-AP前药游离酸6，接着用饱和碳酸氢 钠溶液处理并用反相柱纯化，转化成二钠盐25。
采用适当的含磷酸盐的取代的苄基接头例如21，通过基本上相同的路 径合成另一个取代的邻位前药。将这些接头与25偶合，然后经官能团处理， 得到前药(附图3)。该合成证明本发明前药可很容易转化成其相应磷酸盐。 这些磷酸盐化合物具有优良的水溶性(明显高于其非前药形式)。母体3-AP 在水溶液中的溶解度小于0.1mg/ml，而前药的溶解度为16-35mg/ml。
经上述一般性描述后，下面的实施例旨在示例说明优选的及其他实施 方案和比较。这些实施例不应将认为是对前述以及后附权利要求定义的本 发明范围的限制。采用类似的方法学和/或本领域易得到的已知合成方法， 可很方便地合成未在本申请实施例部分中明确示例的其它化合物。通过直 接采用这里所述的合成方法，或者采用本领域已知技术对该合成方法进行 改进/修饰，本领域普通技术人员可很方便地合成所述的所有化合物。
实施例
所有试剂均以商业级产品购入，没有进一步纯化，如有必要，可在使 用前干燥和/或蒸馏处理溶剂。所有NMR光谱(1H、13C和31p)均采用Brucker AC300光谱仪测定。化学位移(相对于四甲基硅烷)以百万分之一(ppm)计。 偶合常数以赫兹(Hz)记录。快速柱色谱法(FCC)采用Merck硅胶60(230-400 目)，所有三甲基甲硅烷基乙基(TMSE)保护的化合物均用三乙胺预处理。反 相柱色谱(RPCC)用CAT凝胶(Waters公司，制备柱C18125，55-105μm) 填充，用milli-Q级去离子水洗脱。
实施例1-3制备的烟酸(20)的通用方法
实施例1
制备2-氯代烟酸甲酯(18)
向在1，4-二噁烷(500ml)中的2-氯代烟酸酸(Aldrich，100.0g，0.63mol) 混合物中加入亚硫酰氯(70ml，0.96mol)。将悬浮液于回流下加热22小时， 用气体分离器吸收氯化氢气体。蒸发溶剂后，将残留物溶于甲醇(300ml)中。 于0℃，向溶液中滴加三乙胺(TEA，120ml，1.26mol)，用时2小时。蒸发溶 剂，将残留物悬浮于乙酸乙酯中。过滤除去沉淀。浓缩滤液，得到油状的 酯18(92.3g，86％)：
Rf(1∶5v/v乙酸乙酯-己烷)0.38。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.53(dd，4.8Hz，1H)，8.19(dd，7.6Hz，1H)， 7.37(dd，7.7Hz，1H)和3.97(s，3H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ164.5，151.6，149.6，140.0，126.4，121.9和52.5.
实施例2
制备2-苯乙烯基烟酸甲酯(19)
向在DMF(450ml)中的酯18(48.8g，0.28mol)的溶液中加入苯乙烯 (165ml，1.42mol)、醋酸钯(6.5g，30mmol)、乙酸钠(47g，0.57mol)和三苯膦 (30g，0.11mol)。混合物与回流下加热22小时。经Celite垫过滤除去钯催 化剂。减压浓缩滤液，残留物溶于最低量的乙酸乙酯中。向上述溶液中加 入己烷。过滤除去沉淀后，浓缩滤液。所得粗产物经FCC(1∶1v/v乙酸乙酯 -己烷)纯化，得到浅黄色油状的酯19(55.0g，81％)：
Rf(1∶5v/v乙酸乙酯-己烷)0.41。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.70(dd，1H)，8.10(dd，1H)，8.16(d，1H)， 7.94(d，1H)，7.64(d，2H)，7.4-7.3(m，3H)，7.18(dd，1H)和3.94(s，3H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ166.7，155.3，152.0，138.6，136.7，135.9，128.6， 128.5，127.5，24.8，123.8，121.3和52.4.
实施例3
制备2-苯乙烯基烟酸(20)
于环境温度下，用3N的NaOH溶液(110ml，0.25mol)处理在THF(100ml) 中的酯19(55.0g，0.23mol)溶液21小时。除去溶剂后，残留物用水和乙醚 吸收。分离相，水相用醚(2×)洗涤。所得水相用2N的HCl溶液中和，然 后过滤收集沉淀，得到奶油色固体形式的酸20(50.2g，97％)：
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.72(dd，1H)8.19(dd1H)，8.10(d，1H)， 7.86(d，1H)，7.62(d，2H)和7.4-7.3(m，4H)。
13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ167.9，153.7，151.8，138.6，136.4，134.5， 128.9，128.7，127.2，125.3和122.1.
实施例4-5制备磷酸盐接头(21，26a-k)的通用方法
实施例4
制备二(2-三甲基甲硅烷基乙基)亚磷酸盐(TMSE-亚磷酸盐)
于-78℃，向在含有吡啶(11.4ml，0.14mol)的乙醚(200ml)中的2-三甲基 甲硅烷)乙醇(Aldrich，25.0g，0.21mol)的溶液中，一次加入三氯化磷(6.2ml， 70mmol)。反应混合物于搅拌下保持5分钟，然后用乙醚(500ml)稀释。加 温至环境温度后，混合物连续搅拌18小时，过滤除去沉淀，然后滤液用氨 气吹泡10分钟。经Celite垫过滤除去沉淀，浓缩滤液，得到无色的油状TMSE- 亚磷酸盐(20.7g，99％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ6.76(d，1H)，4.13(m，4H)，1.07(m，4H)和0.0(s， 18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ64.0(d)，19.6(d)和-1.6(d)。
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ18.5。
实施例5
制备2-(TMSE-膦酰氧基)苯甲醇(21，26a-k)
通用方法向在乙腈(40ml)中相应的2-羟基苄醇(10mmol)溶液中，加 入N，N′-二异丙基乙胺(DIEA，11mmol)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP，1mmol) 和四氯化碳(50mmol)。于-30℃搅拌下，立即向该溶液中加入二(2-三甲基甲 硅烷基乙基)亚磷酸盐(冰箱贮藏，11mmol)。加温至环境温度后，反应混合 物搅拌3小时。减压蒸发溶剂，残留产物用FCC(1∶1v/v乙酸乙酯-己烷)纯 化，得到相应TMSE-保护的磷酸盐接头(21，26a-k)。
2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基苄醇(苯基5位上是H，21a)
按照上述方法，经2-羟基苄醇(15.0g，0.12mmol)得到油状的邻位磷酸 盐接头2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基苄醇(39.78g，81％)：
1HNMR(300兆赫，CDCl3)δ7.43(d，J＝8.5Hz，1h)，7.27-7.16(m，3h)， 4.63(s，2h)，4.29-4.19(m，4h)，4.12(m，4h)，1.14-1.08(m，4h)，和0.00(s， 18h)；
13CNMR(75兆赫，CDCl3)148.4(d，J＝8.84hz)，133.0(d，J＝4.59Hz)， 130.9，129.1，25.8，121.0(d，J＝4.47Hz)，67.5(d，J＝6.93)，60.1，9.5(d，J＝5.76Hz) 和-1.563。
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ6.4.
2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-5-氯代苄基醇(21)
按照上述方法，经5-氯代-2-羟苄基醇醇(5.0g，32mmol)，得到油状 21(12.2g，88％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.33(d，1H)，7.11(m，1H)，7.02(m，1H)，4.49(s， 2H)，4.12(m，4H)，1.00(m，4H和-0.07(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ146.5(d)，134.7(d)，130.8，130.2，128.6， 122.0(d)，67.7(d)，59.4，19.5(d)和-1.6。
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ6.1.
2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-5-氟代苄基醇(26a)
按照上述方法，经5-氟代-2-羟苄基醇(17.0g，119mmol)得到油状 26a(31.7g，62％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.2-7.1(m，1H)，7.0-6.9(m，1H)，4.63(s，1H)， 4.3-4.1(m，4H)，1.2-1.1(m，4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ159.8(d)，143.7(dd)，135.2(dd)，121.8(dd)， 116.4(d)，115.0(d)，67.6(d)，59.4，19.5(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ6.4.
19FNMR(282MHz，CDCl3)δ-59.8.
2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-5-硝基苄醇(26b)
按照上述方法，经2-羟基-5-硝基苄醇(4.5g，27mmol)得到油状26b(6.4g， 53％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.14(m，1H)，7.81(m，1H)，7.14(m，1H)， 4.48(s，2H)，4.06(m，4H)，0.90(m，4H)和-0.20(m，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ152.0(d)，144.6，134.7(d)，123.7，123.4，119.8， 67.9(d)，58.4，19.3(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ4.4.
2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-5-甲氧苄醇(26c)
按照上述方法，经2-羟基-5-甲氧苄醇(11.0g，25mmol)得到油状的 26c(7.7g，70％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.06(dd，1H)，6.94(d，1H)，6.74(dd，1H)， 4.57(s，2H)，4.34.1(m，4H)，3.74(s，3H)，1.1-1.0(m，4H)和0.0(m，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ157.1，141.7(d)，134.0(d)，121.9(d)，125.3， 114.5，67.5(d)，60.2，55.6，19.6(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ6.9.
2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-5-三氟甲氧苄醇(26d)
按照上述步骤，经2-羟基-5-三氟甲氧苄醇(1.9g，9.1mmol)得到油状 26d(3.3g，62％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.20(d，1H)，7.19(dd，1H)，7.09(dd，1H)， 4.61(s，2H)，4.24(m，4H)，1.08(m，4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ146.4(dd)，135.0(d)，123.0，122.1，121.4， 67.8(d)，59.6，19.6(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ6.2.
19FNMR(282MHz，CDCl3)δ-58.7.
2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-5-三氟甲基苄醇(26e)
按照上述方法，经2-羟基-5-三氟甲基苄醇(4.1g，22mmol)得到26e(7.9g， 77％)油状：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.72(brs，1H)，7.51(dd，1H)，7.29(d，1H)， 4.66(s，2H)，4.23(m，4H)，1.09(m，4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ150.6(d)，133.8(d)，127.7(d)，126.1，121.3(d)， 68.0(d)，59.6，19.6(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.8.
19FNMR(282MHz，CDCl3)δ-62.9.
2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-3，5-二氯苄醇(26f)
按照上述方法，经3，5-二氯-2-羟苄基醇(4.6g，24mmol)得到油状的 26f(7.2g，63％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.34(d，1H)，7.32(dd，1H)，4.56(s，2H)， 4.25(m，4H)，1.08(m，4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ149.9，143.3(d)，136.9(d)，131.2(d)，129.9，129： 5，127.6(d)，68.3(d)，59.8，19.5(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.7.
2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-4，5-二氯苄醇(26g)
按照上述方法，经4，5-二氯-2-羟苄基醇(3.6g，18mmol)，得到油状 26g(5.2g，59％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.53(s，1H)，7.28(s，1H)，4.55(s，2H)，4.21(m， 4H)，1.08(m，4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ146.6(d)，133.5(d)，131.9(d)，131.6，129.5(d)， 123.0(d)，68.1(d)，59.1，19.6(d)和-1.5.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ6.0.
2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-5，6-二氯苄基醇(26h)
按照上述方法，经5，6-二氯-2-羟苄基醇(4.8g，25mmol)得到油状 26h(8.6g，73％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.35(d，1H)，7.04(dd，1H)，4.76(s，2H)， 4.22(m，4H)，1.08(m，4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ147.6(d)，134.7，133.5(d)，130.6(d)，129.9， 120.8(d)，68.1(d)，57.3，19.6(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ6.4.
2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-3-甲苄基醇(26i)
按照上述方法，经2-羟基-3-甲苄基醇(2.0g，14mmol)得到油状26i(1.7g， 88％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.16(m，1H)，7.0-6.9(m，2H)，4.48(s，2H)， 4.13(m，4H)，2.22(s，3H)，0.97(m，4H)和-0.09(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ146.9(d)，133.5(d)，131.0，130.4(d)，129.4， 125.6(d)，67.6(d)，60.1，19.5(d)，16.8和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ6.9.
2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-4-氯代苄基醇(26j)
按照上述方法，经4-氯代-2-羟苄基醇(4.2g，26mmol)，得到油状 26j(9.6g，84％)：
Rf(4∶1v/v乙酸乙酯-己烷)0.67.
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.27(d，1H)，7.2-7.1(m，2H)，4.55(s，2H)， 4.21(m，4H)，1.07(m，4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ148.5(d)，133.9，131.7(d)，131.5，126.0， 121.4(d)，67.9(d)，59.4，19.5(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.8.
2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-4-甲氧苄醇(26k)
按照上述方法，经2-羟基-4-甲氧苄基醇(2.7g，17mmol)，得到油状 26k(2.5g，33％)：
Rf(4∶1v/v乙酸乙酯-己烷)0.70.
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.29(d，1H)，6.8-6.7(m，2H)，4.53(s，2H)， 4.22(m，4H)，3.75(s，3H)，1.09(m，4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ160.1(d)，149.1(d)，131.9，125.3(d)，111.2， 107.3(d)，67.6(d)，59.7，55.5，19.6(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ6.4.
实施例6-103-AP前药(25，30a-k)的通用制备方法
实施例6
制备(2-苯乙烯基吡啶-3-基)氨基甲酸2-(TMSE-膦酰氧基)苄酯(22，27a- k)(Curtius重排法)
通用方法向在含有三乙胺(TEA，32mmol)的苯(100ml)中的2-苯乙烯 基烟酸(20，20mmol)溶液中，加入二苯基磷酰基叠氮(32mmol)。该溶液加热 回流10分钟，然后加入按上述方法制备的相应TMSE保护的磷酸盐接头(21 或26a-k，20mmol)。反应混合物于回流下保持3小时。然后，减压蒸发掉 溶剂。残留产物经FCC(1∶4v/v乙酸乙酯-己烷)纯化，得到相应的氨基甲酸 酯(22或27a-k)。
(2-苯乙烯基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基- 苄酯(22a)
按照上述步骤，由2-二(2-三甲基硅烷基乙基)膦酰氧基苄醇 (21a)(29.72g，0.073mol)获得粗品氨基甲酸盐，无需纯化即可供另一反应使 用。
(2-苯乙烯基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基- 5-氯代苄酯(22)
按照上述步骤，经21(9.4g，21mmol)，得到油状22(10.6g，58％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.23(d，1H)，7.92(brs，1H)，7.56(d，1H)，7.4- 7.0(m，11H)，5.11(s，2H)，4.10(m，4H)，0.94(m，4H)和-0.14(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ153.7，151.9，147.3(d)，146.8，145.2，136.5， 134.8，131.4，130.2，129.5，12，129.2，128.5，128.3，127.2，122.3，121.3，121.2， 67.4(d)，61.6，19.4(d)和-1.7.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.1.
C31H42ClN2O6PSi2质量计算值：661.277；实测值：661.2
(2-苯乙烯基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基- 5-氟苄基酯(27a)
按照上述步骤，由26a(31.0g，73mmol)获得粗品氨基甲酸盐27a，无需 纯化可直接供另一反应使用。
(2-苯乙烯基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基- 5-硝基苄基酯(27b)
按照上述方法，经26b(4.3g，9.6mmol)，得到油状27b(2.3g，35％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.3-7.0(m，14H)，5.21(s，2H)，4.16(m，4H)， 0.99(m，4H)和-0.12(m，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ153.5，153.2(d)，149.9，145.6，144.3，136.4， 135.1，131.1，129.3，129.0(d)，128.5，128.4，127.2，124.9，124.8，122.4， 120.9，120.3，68.0(d)，62.1，19.5(d)，17.1和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ4.5.
(2-苯乙烯基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基- 5-甲氧基苄酯(27c)
按照上述方法，经26c(6.0g，26mmol)获得粗品氨基甲酸盐27c，无需 纯化可直接供另一反应使用。
(2-苯乙烯基吡啶-3-基)氨基甲酸2-氨基甲酸(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦 酰氧基-5-三氟甲氧基苄酯(27d)
按照上述方法，经26d(1.9g，8.5mmol)，得到油状27d(3.4g，83％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.39(dd，1H)，8.13(brs，1H)，7.74(d，1H)， 7.60(m，2H)，7.41(dd，1H)，7.4-7.1(m，7H)，5.30(s，2H)，4.27(m，4H)，1，10(m， 4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ153.4，147.3(d)，145.7，145.4，136.6，135.4， 131.2，129.8，129.7，129.2(d)，128.6，128.5，127.4，127.0，125.2，122.7，122.5， 122.2，121.5，120.8，120.0(d)，118.6，67.6(d)，62.0，19.6(d)和-1.6。
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.3.
19FNMR(282MHz，CDCl3)δ-58.7.
(2-苯乙烯基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基- 5-三氟甲基苄酯(27e)
按照上述方法，经26e(5.1g，11mmol)，得到油状27e(5.3g，71％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.40(dd，1H)，8.14(brs，1H)，7.74(d，2H)，7.6- 7.5(m，4H)，7.4-7.1(m，8H)，5.29(s，2H)，4.29(m，4H)，1.11(m，4H)和0.0(s， 18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ153.4，145.4(m)，136.5，135.4，131.1，129.7， 128.6，128.5，128.2，128.1，127.4，127.1(d)，122.5，120.8，120.5，120.0(d)，67.7(d)， 61.9，19.6(d)和1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.0.
19FNMR(282MHz，CDCl3)δ-62.7.
(2-苯乙烯基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基- 3，5-二氯代苄酯(27f)
按照上述方法，经26f(6.3g，13mmol)，得到油状27f(7.1g，76％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.39(dd，1H)，8.11(brs，1H)，7.74(d，1H)， 7.59(brd，2H)，7.4-7.2(m，8H)，7.18(dd，2H)，5.35(s，2H)，4.29(m，4H)，1.11(m， 4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ153.3，145.4(d)，136.5，135.4，131.9(d)，131.1， 131.0，130.2，129.8，129.7，128.7，128.6，128.3，128.0(d)，127.4，122.5，120.8，67.9(d)， 62.2，19.5(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.0.
(2-苯乙烯基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基- 4，5-二氯代苄酯(27g)
按照上述方法，经26g(11.3g，50mmol)，得到油状27g(17.4g，75％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.38(dd，1H)，8.12(brs，1H)，7.74(d，1H)， 7.60(dd，2H)，7.53(s，1H)，7.51(d，1H)，7.4-7.2(m，6H)，7.17(dd，2H)，5.23(s，2H)， 4.27(m，4H)，1.10(m，4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ153.4，147.7(d)，145.4，136.6，135.4，133.1， 131.3，131.2，128.9，128.6，128.5，127.7(d)，127.4，122.5，120.8，67.8(d)，61.5，19.6(d) 和-1.6.
31pNMR(121MHz，CDCl3)δ5.2.
(2-苯乙烯基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基- 5，6-二氯代苄酯(27h)
按照上述方法，经26h(6.2g，28mmol)，得到油状27h(9.6g，75％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.38(dd，1H)，8.20(brs，1H)，7.73(d，1H)， 7.60(brd，2H)，7.48(d，1H)，7.4-7.2(m，7H)，7.18(dd，2H)，5.48(s，2H)，4.28(m， 4H)，1.10(m，4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ153.4，149.2(d)，145.2，136.5，135.4，134.7， 131.3，131.0，129.8，129.4，128.6，128.5，127.4，127.3(d)，122.5，120.7，119.6(d)， 67.7(d)，59.9，19.6(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.0.
(2-苯乙烯基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基- 3-甲基苄酯(27i)
按照上述方法，经26i(1.4g，6.2mmol)，得到橙油状27i(1.5g，53％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.23(dd，1H)，7.97(brs，1H)，7.66(m，1H)， 7.58(d，1H)，7.46.9(m，10H)，5.27(s，2H)，4.11(m，4H)，2.27(s，3H)，0.94(m，4H) 和-0.11(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ153.9，147.6(d)，146.4，145.1，136.6，134.7， 131.7，131.6，131.0，130.8(d)，128.5，128.4(d)，128.3，127.6，127.3，125.3，122.3， 121.2，67.1(d)，62.9，19.5(d)，17.1和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.6.
C32H45N2O6PSi2质量计算值：640.859；实测值：640.2
(2-苯乙烯基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基- 4-氯代苄酯(27j)
按照上述方法，经26j(9.3g，21mmol)，得到油状27j(12.6g，87％)：
Rf(1∶1v/v乙酸乙酯-己烷)0.82.
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.28(dd，1H)，8.15(brs，1H)，7.72(d，1H)， 7.60(d，2H)，7.47.3(m，7H)，7.2-7.1(m，2H)，5.26(s，2H)，4.28(m，4H)，1.11(m， 4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ153.6，149.7(d)，145.2，136.6，135.3，135.1， 131.4，131.3，128.6，128.5，127.4，125.9(d)，125.4，122.4，120.9(d)，120.8，67.6(d)， 62.1，19.5(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.1.
(2-苯乙烯基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基- 4-甲氧基苄酯(27k)
按照上述方法，经26k(2.8g，6.5mmol)，得到油状27k(3.7g，86％)：Rf(1∶ 1v/v乙酸乙酯-己烷)0.50.
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.36(dd，1H)，8.18(brs，1H)，7.72(d，1H)，7.4- 7.3(m，6H)，7.62(d，2H)，7.2-7.1(m，1H)，6.97(m，1H)，6.71(dd，1H)，5.24(s，2H)， 4.29(m，4H)，3.80(s，3H)，1.11(m，4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ160.5，153.9，150.0(d)，145.0，136.7，135.1， 131.9，131.6，130.0，128.6，128.4，127.4，122.4，120.9，119.2(d)，110.4，67.3(d)，62.4， 55.5，19.6(d)和1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.2.
实施例7
制备(2-甲酰吡啶-3-基)氨基甲酸2-(TMSE-膦酰氧基)苄酯(23，28a-k)(臭 氧分解法)
通用方法将相应的2-苯乙烯基吡啶(22或27a-k，10mmol)溶于二氯甲 烷(50ml)和乙醇(40ml)中。于-50℃，用臭氧处理该浅黄色溶液，直到溶液变 为浅蓝色。溶液通过氮气吹泡30分钟，以排出过量臭氧。然后向该溶液中 加入甲硫醚(dimethylsulfide)(5ml)，所得化合物于室温下搅拌2小时。减压 蒸发溶剂，用FCC(1∶9v/v乙酸乙酯-己烷)纯化残留的产物，得到相应的吡 啶-2-醛缩(carboxaldehyde)(23或28a-k)。
(2-甲酰吡啶-3-基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基乙基-膦酰氧基)苄酯 (23a)
按照上述方法，经上述制备的粗品22a，得到油状23a(29.81g，73％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ10.49(s，1H)，10.06(s，1H)，8.84(d，J＝8.36Hz， 1H)，8.43(d，J＝5.36Hz，1H)，7.49-7.16(m，5H)，5.34(s，2H)，4.32-4.24(m，4H)， 1.11(dd，J＝8.59Hz，6.57Hz，4H)和0.0(18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ197.0，153.2，149.1(d，J＝6.45Hz)，143.7，138.5， 136.7，130.1，129.8，128.6(d，J＝6.68Hz)，126.3，124.9，120.0，67.2(d，J＝5.39Hz， 2C)，62.5，19.5(d，J＝6.58Hz，2C)，-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.2.
(2-甲酰吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-5-氯 代苄酯(23)
按照上述方法，经22(2.4g，3.7mmol)，得到油状23(1.6g，72％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ10.38(brs，1H)，9.90(s，1H)，8.67(d，1H)， 8.28(dd，1H)，7.47.3(m，2H)，7.23(dd，1H)，7.13(dd，1H)，5.14(s，2H)，4.12(m， 4H)，0.97(m，4H)和-0.14(m，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ197.0，152.9，147.3(d)，143.7，138.3，136.7， 130.1，129.6，129.5，128.6，128.5，126.2，121.3，67.4(d)，61.6，19.4(d)和-1.7.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.1.
(2-甲酰吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-5-氟 代苄酯(28a)
按照上述方法，经粗品27a(31.0g，73mmol)，得到油状28a(26.9g，64％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ10.58(s，1H)，10.10(s，1H)，8.86(d，1H)， 8.48(dd，1H)，7.52(m，1H)，7.4-7.3(m，1H)，7.21(dd，1H)，7.1-6.9(m，1H)，5.30(s， 2H)，4.4-4.2(m，4H)，1.21.0(m，4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ197.1，159.3(d)，152.9，144.5(dd)，143.7，143.5， 138.4，136.8，121.4(dd)，116.2(d)，115.9(d)，67.3(d)，61.8，19.5(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.5.
19FNMR(282MHz，CDCl3)δ-59.3.
(2-甲酰吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-5-硝 基苄基酯(28b)
按照上述方法，经27b(4.2g，9.4mmol)，得到油状28b(2.8g，50％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ10.42(brs，1H)，9.89(s，1H)，8.64(d，1H)， 8.28(dd，1H)，8.21(d，1H)，8.05(dd，1H)，7*47(d，1H)，7.33(dd，1H)，5.21(s，2H)， 4.17(m，4H)，0.98(m，4H)和-0.13(m，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ197.0，153.5(d)，152.7，144.3，143.9，138.1， 136.8，128.6，128.3(d)，126.2，125.4，125.2，120.3，67.9(d)，61.4，19.5(d)和-1.7.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ4.5.
(2-甲酰吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-5-甲 氧基苄酯(28e)
按照上述方法，经粗品27c(7.5g，17mmol)，得到油状28e(9.8g，73％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ10.37(s，1H)，9.93(s，1H)，8.71(d，1H)，8.30(d， 1H)，7.34(dd，1H)，7.19(d，1H)，6.85(d，1H)，6.70(d，1H)，5.18(s，2H)，4.2-4.0(m， 4H)，3.66(s，3H)，1.1-0.9(m，4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ196.9，156.4，153.1，143.6，142.4(d)，138.5， 136.7，128.6，127.7(d)，126.2，120.9，115.1，114.3，67.1(d)，62.3，55.5，19.4(d)和- 1.7.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.8.
(2-甲酰吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-5-三 氟甲氧基苄酯(28d)
按照上述方法，经27d(4.7g，6.6mmol)，得到油状28d(3.2g，75％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ10.54(brs，1H)，10.06(s，1H)，8.82(d，1H)， 8.44(dd，1H)，7.48(dd，1H)，7.44(dd，1H)，7.32(d，1H)，7.25(s，1H)，7.2-7.1(m， 1H)，5.30(s，2H)，4.26(m，4H)，1.10(m，4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ197.2，153.0，147.1(d)，145.7，143.9，138.4， 136.9，129.8，128.8，128.7，126.4，122.6，122.2，121.3，120.0，119.9，67.6(d)，61.8， 19.5(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.3.
19FNMR(282MHz，CDCl3)δ-58.8.
(2-甲酰吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-5-三 氟甲基苄酯(28e)
按照上述方法，经27e(12.2g，18mmol)，得到油状28e(6.9g，63％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ10.54(brs，1H)，10.06(d，1H)，8.82(brd，1H)， 8.44(dd，1H)，7.72(brs，1H)，7.6-7.5(m，2H)，7.48(dd，1H)，7.3-7.1(m，2H)， 5.33(s，2H)，4.27(m，4H)，1.10(m，4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ197.1，153.0，151.5(d)，143.9，138.4，136.9， 129.8，129.7，128.7，127.7，127.6，127.3(d)，127.1，127.0，126.4，126.3，125.2， 120.3(d)，120.0(d)，67.7(d)，61.8，19.6(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ4.9.
19FNMR(282MHz，CDCl3)δ-62.7.
(2-甲酰吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-3，5- 二氯代苄酯(28f)
按照上述方法，经27f(8.0g，12mmol)，得到油状28f(5.1g，71％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ10.54(brs，1H)，10.05(s，1H)，8.79(d，1H)， 8.42(dd，1H)，7.46(dd，1H)，7.35(dd，2H)，7.24(s，1H)，5.38(s，2H)，4.27(m，4H)， 1.12(m，4H)和0.0(m，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ197.2，152.8，149.9，143.9，143.6(d)，138.4， 136.8，131.8(d)，131.0(d)，130.1，128.7，128.0(d)，127.8(d)，126.3，120.0(d)， 67.8(d)，62.0，19.6(d)和1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.1.
(2-甲酰吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-4，5- 二氯代苄酯(28g)
按照上述方法，经27g(17.4g，25mmol)，得到油状28g(13.4g，86％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ10.51(brs，1H)，10.05(s，1H)，8.79(d，1H)， 8.42(dd，1H)，7.53(dd，1H)，7.5-7.4(m，1H)，7.24(s，1H)，6.96(dd，1H)，5.23(s， 2H)，4.28(m，4H)，1.10(m，4H)和0.0(m，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ197.2，152.9，147.4(d)，144.0，138.3，136.9， 133.1，131.0，128.8(d)，128.7，127.2(d)，126.3，122.2，122.0，67.8(d)，61.3，19.6(d) 和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.1.
(2-甲酰吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-5，6- 二氯代苄酯(28h)
按照上述方法，经27h(9.5g，14mmol)，得到油状28h(6.5g，77％)：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ10.44(brs，1H)，10.05(s，1H)，8.86(d，1H)， 8.44(dd，1H)，7.50(d，1H)，7.47(d，1H)，7.41(d，1H)，7.38(m，1H)，5.46(s，2H)， 4.25(m，4H)，1.10(m，4H)和0.0(m，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ197.0，153.0，149.9，149.2(d)，143.8，138.5， 136.8，135.0，131.2，129.8，129.6，128.7，126.6(d)，126.3，119.5(d)，67.7(d)， 59.9，19.5(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ4.9.
(2-甲酰吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-3-甲 基苄酯(28i)
按照上述步骤，经27i(1.5g，2.2mmol)，得到28i(1.1g，86％)油状：
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ10.35(brs，1H)，9.92(s，1H)，8.71(d，1H)， 8.28(dd，1H)，7.32(dd，1H)，7.16(d，1H)，7.05(d，1H)，6.96(dd，1H)，5.3.1(s，2H)， 4.12(m，4H)，2.28(s，3H)，0.97(m，4H)和-0.12(m，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ196.9，153.2，147.2(d)，143.6，138.6，136.6， 131.6，130.9(d)，128.6，128.0(d)，127.4，126.2，125.3，67.1(d)，62.9，19.4(d)，17.0 和-1.7.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.8.
(2-甲酰吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-4-氯 代苄酯(28j)
按照上述方法，经27j(12.2g，19mmol)，得到油状28j(8.9g，80％)：
Rf(1∶1v/v乙酸乙酯-己烷)0.66.
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ10.49(brs，1H)，10.04(s，1H)，8.80(d，1H)， 8.42(dd，1H)，7.5-7.4(m，3H)，7.16(dd，1H)，5.26(s，2H)，4.27(m，4H)，1.11(m，4H) 和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ197.1，153.1，149.3(d)，143.8，138.5，136.8， 135.0，131.0，128.7，126.3，125.3(d)，125.2，120.5(d)，67.5(d)，61.9，19.5(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.0.
(2-甲酰吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基)膦酰氧基-4-甲 氧基苄酯(28k)
按照上述方法，经27k(5.1g，8.0mmol)，得到油状28k(2.7g，58％)：
Rf(1∶1v/v乙酸乙酯-己烷)0.44.
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ10.50(brs，1H)，10.05(s，1H)，8.84(d，1H)， 8.42(dd，1H)，7.46(dd，1H)，7.36(dd，1H)，7.01(s，1H)，6.71(dd，1H)，5.24(s，2H)， 4.27(m，4H)，3.80(s，3H)，1.10(m，4H)和0.0(s，18H)。
13CNMR(75MHz，CDCl3)δ197.0，160.9，153.4，150.2(d)，143.6，138.7， 136.7，131.7，128.7，126.3，118.5(d)，110.6，106.1(d)，67.3(d)，62.4，55.5，19.5(d)和 -1.6.
31PNMR(121MHz，CDCl3)δ5.0.
实施例8
制备吡啶-2-醛缩氨基硫脲(pyridine-2-carboxaldehydethiosemi carbazone)(24，29a-k)
通用方法将相应的吡啶-2-甲醛(23、23a或28a-k，10mmol)溶于乙醇- 水(2∶1v/v，150ml)中。向溶液中加入氨基硫脲(11mmol)。溶液于环境温度下 搅拌30分钟。加入水(50ml)后，反应混合物强烈搅拌2小时。过滤收集黄 色沉淀，用乙醇-水(1∶4v/v)洗涤，并真空干燥，得到相应的吡啶-2-醛缩氨 基硫脲(24，24a，29a-k)。
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基硅甲烷基乙基) 膦酰氧基-5-氯代苄基酯(24)(2-Thiosemicarbazonomethylpyridin-3-yl) carbamicacid2-bis(2-trimethylsilylethyl)phosphonooxy-5-chlorobenzyl ester)
按照上述方法，经23(6.9g，12mmol)，得到黄色固体24(4.9g，63％)：
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ11.77(brs，1H)，10.03(brs，1H)，8.40(dd， 1H)，8.28(brs，1H)，8.26(s，1H)，7.94(brs，1H)，7.5-7.4(m，4H)，5.20(s，2H)， 4.06(m，4H)，0.98(m，4H)和-0.03(m，18H)。
13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ178.5，153.4，148.0(d)，144.2，142.9， 141.0，133.9，129.5(d)，128.9，128.4，128.0，124.4，121.6，65.1(d)，61.2，18.9(d)和-1.5.
31PNMR(121MHz，DMSO-d6)δ9.8.
对于C25H39ClN5O6PSSi2质量计算值：660.267；实测值：660.
2(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基) 膦酰氧基苄酯(24a)
按照上述方法，经23a(29.74g，0.54mol)，得到黄色固体24a(33.67g， 90％))：
1HNMR(DMSO-d6，300MHz)：d11.76(s，1H)，10.04(s，1H)，8.38(d，J＝4.32 Hz，1H)，8.29(s，2H)，7.86-7.26(m，5H)，5.27(s，2H)，4.264.18(m，4H)，1.05(dd， J＝9.08Hz，7.64Hz，4H)，0.0(s，18H)；
13CNMR(DMSO-d6，75MHz)：d178.9，153.3，148.0(d，J＝6.42Hz)，144.6， 144.3，140.6，133.9，129.5，127.2(d，J＝5.54Hz)，125.2，124.1，119.8(d，J＝4.32Hz)， 119.6，66.7(d，J＝7.8Hz，2C)，61.3，18.9(d，J＝6.5Hz，2C)，-1.6；
31PNMR(DMSO-d6，121MHz)：d9.7。
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基硅烷基乙基)膦 酰氧基-5-氟代苄基酯(29a)
按照上述方法，经28a(14.3g，25mmol)，得到黄色固体29a(12.9g，80％)：
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ11.85(s，1H)，10.13(s，1H)，8.45(d，1H)， 8.26(s，1H)，7.5-7.1(m，5H)，5.21(s，2H)，4.2-4.0(m，4H)，1.0-0.9(m，4H)和0.0(s， 18H)。
13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ178.6，159.8，156.0，153.4，145.1(d)，143.5， 141.5，140.4，134.2，129.5，124.5，121.4(d)，115.5，64.4(d)，61.3，18.9(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，DMSO-d6)δ10.5.
19FNMR(282MHz，DMSO-d6)δ-62.5.
C25H39FNSO6PSSi2质量计算值：643.813实测值：644.2
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基) 膦酰氧基-5-硝基苄基酯(29b)
按照上述方法，经28b(1.6g，2.7mmol)，得到黄色固体29b(1.3g，77％)：
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ11.86(brs，1H)，10.14(brs，1H)，8.4-8.2(m， 4H)，7.87(brs，2H)，7.64(m，1H)，7.52(m，1H)，5.26(s，2H)，4.05(m，4H)，0.97(m， 4H)和-0.03(m，18H)。
13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ178.6，155.3(d)，153.4，143.7，142.7， 140.7，134.1，128.1(d)，125.2，124.6，124.5，120.1，64.8(d)，61.2，18.9(d)和-1.5.
31PNMR(121MHz，DMSO-d6)δ9.2.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基) 膦酰氧基-5-甲氧苄基酯(29c)
按照上述方法，经28c(5.0g，8.8mmol)，得到黄色固体29c(4.4g，77％)：
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ11.85(s，1H)，10.08(s，1H)，8.41(d，1H)， 8.35(d，1H)，8.30(s，1H)，8.03(s，2H)，7.51(dd，1H)，7.26(d，1H)，7.01(d，1H)， 6.90(dd，1H)，5.26(s，2H)，4.2-4.0(m，4H)，3.75(s，3H)，1.1-0.11(m，4H)和0.0(s， 18H)。
13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ178.7，155.7，153.6，143.9，142.6(d)，134.2， 129.4，128.4(d)，124.5，121.1，114.1，113.9，64.9(d)，61.9，55.6，19.1(d)和-1.4.
31PNMR(121MHz，DMSO-d6)δ10.3.
C26H42NSO7PSSi2质量计算值：655.848；实测值：656.2
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基) 膦酰氧基-5-三氟甲氧苄酯(29d)
按照上述方法，经28d(2.5g，3.9mmol)，得到黄色固体29d(1.9g，68％)：
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ11.81(s，1H)，10.04(brs，1H)，8.42(d，1H)， 8.26(s，1H)，7.95(brs，1H)，7.5-7.2(m，4H)，5.24(s，2H)，4.07(m，4H)，0.96(m，4H) 和-0.04(m，18H)。
13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ178.4，153.4，147.8(d)，144.1，144.0，133.9， 129.4(d)，124.4，121.9，121.7，121.6，121.4，118.3，65.1(d)，61.2，18.9(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，DMSO-d6)δ9.8.
19FNMR(282MHz，DMSO-d6)δ-53.0.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基) 膦酰氧基-5-三氟甲基苄酯(29e)
按照上述方法，经28e(5.3g，8.5mmol)，得到黄色固体29e(3.6g，61％)：
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ11.81(s，1H)，10.03(brs，1H)，8.42(d，1H)， 8.4-8.3(m，2H)，8.26(s，1H)，7.89(brs，1H)，7.79(s，1H)，7.75(d，2H)，7.56(d，2H)， 7.49(dd，1H)，5.27(s，2H)，4.06(m，4H)，0.97(m，4H)和-0.04(m，18H)。
31PNMR(121MHz，DMSO-d6)δ9.5.
19FNMR(282MHz，DMSO-d6)δ-56.2.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基) 膦酰氧基-3，5-二氯苄酯(29f)
按照上述方法，经28f(4.8g，7.7mmol)，得到黄色固体29f(4.6g，85％)：
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ11.75(s，1H)，10.04(s，1H)，8.39(d，1H)， 8.30(d，1H)，8.26(s，1H)，7.91(brs，1H)，7.69(dd，1H)，7.50(d，1H)，7.43(dd，1H)， 5.29(s，2H)，4.24(m，4H)，1.03(m，4H)和-0.01(m，18H)。
31PNMR(121MHz，DMSO-d6)δ10.3.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基) 膦酰氧基-4，5-二氯苄酯(29g)
按照上述方法，经28g(2.0g，3.2mmol)，得到黄色固体29g(1.5g，70％)：
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ11.85(s，1H)，10.08(s，1H)，8.42(d，1H)， 8.31(d，1H)，8.26(s，1H)，7.89(m，1H)，7.70(s，1H)，7.59(s，1H)，7.5-7.2(m，2H)， 5.18(s，2H)，4.02(m，4H)，0.95(m，4H)和0.0(m，18H)。
13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ178.6，153.3，148.8，143.8，142.4，140.6， 134.0，130.8，130.2(d)，129.5，128.3(d)，125.8(d)，124.4，121.5，119.9，64.9(d)， 60.8，18.9(d)和-1.5.
31PNMR(121MHz，DMSO-d6)δ9.7.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基) 膦酰氧基-5，6-二氯苄酯(29h)
按照上述方法，经28h(5.9g，9.5mmol)，得到黄色固体29h(3.6g，55％)：
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ11.82(s，1H)，9.97(brs，1H)，8.50(m，1H)， 8.41(d，1H)，8.27(d，1H)，8.23(s，1H)，7.72(m，1H)，7.67(d，1H)，7.48(m，1H)， 7.41(d，1H)，7.3-7.1(m，1H)，5.32(s，2H)，4.03(m，4H)，0.96(m，4H)和-0.06(m， 18H)。
13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ178.3，153.3，150.6(d)，143.8，140.8，134.0， 133.8，133.3，131.2，130.3，129.4，126.7(d)，124.4，120.1，119.9(d)，64.8(d)，59.4， 18.9(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，DMSO-d6)δ9.6.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基) 膦酰氧基-3-甲苄基酯(29i)
按照上述方法，经28i(1.1g，1.9mmol)，得到黄色固体29i(0.7g，57％)：
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ11.76(brs，1H)，9.99(brs，1H)，8.42(brs， 1H)，8.37(m，1H)，8.27(brs，1H)，8.24(m，1H)，8.03(brs，1H)，7.45(dd，1H)， 7.25(d，1H)，7.19(d，1H)，7.11(dd，1H)，5.30(s，2H)，4.08(m，4H)，2.29(s，3H)， 1.01(m，4H)和-0.03(m，18H)。
13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ178.7，153.8，147.5(d)，144.4，143.2，141.2， 134.3，131.1，130.7(d)，128.9(d)，126.4，124.9，124.6，65.4(d)，62.4，19.2(d)，16.9 和-1.4.
31PNMR(121MHz，DMSO-d6)δ10.4.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基) 膦酰氧基-4-氯代苄基酯(29j)
按照上述方法，经28j(10.5g，18.5mmol)，得到黄色固体29j(11.8g， 97％)：
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ11.74(s，1H)，10.05(brs，1H)，8.4- 8.3(m，3H)，7.85(brs，1H)，7.56(d，1H)，7.5-7.4(m，3H)，5.21(s，2H)，4.22(m，4H)， 1.04(m，4H)和-0.01(s，18H)。
13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ153.2，148.5，148.4，144.8，144.5，133.8， 133.0，130.8，126.5，126.4，125.4，124.1，119.7，67.2(d)，60.8，18.9(d)和-1.6.
31PNMR(121MHz，DMSO-d6)δ9.5.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-二(2-三甲基甲硅烷基乙基) 膦酰氧基-4-甲氧苄基(29k)
按照上述方法，经28k(2.6g，4.5mmol)，得到黄色固体29k(2.7g，91％)：
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ11.74(d，1H)，9.98(brs，1H)，8.4- 8.3(m，3H)，7.82(brs，1H)，7.44(m，1H)，6.87(m，3H)，5.16(s，2H)，4.19(m， 4H)，3.77(s，3H)，1.03(m，4H)和0.01(s，18H)。
13CNMR(75MHz，DMSO-d6)178.4，160.0，153.2，150.2，148.4，144.8， 144.5，133.8，133.0，130.8，124.1，119.0，110.4，106.0，66.8(d)，61.4，55.3，18.9(d)和- 1.6.
31PNMR(121MHz，DMSO-d6)δ9.6.
实施例9
制备游离的膦酸(6-17)
通用方法于0℃，向在二氯甲烷(300-500ml)的相应TMSE-保护的磷 酸盐(24、24a或29a-k，10mmol)溶液中加入三氟乙酸(TFA，20-50ml)。反应 混合物在冰浴中强烈搅拌2小时。过滤收集沉淀，用冷的二氯甲烷洗涤， 然后真空干燥。通常蒸发掉溶剂，然后将所得残余混合物真空干燥。所得 的相应游离膦酸(6-17和6a未示出)为黄色固体或玻璃状固体。
实施例10
制备膦酸的二钠盐(25，30a-k)
通用方法用饱和的碳酸氢钠(NaHCO3)水性溶液(50-100ml)，中和相 应的游离膦酸(6-17，10mmol)。悬浮液于环境温度下搅拌2小时，然后加入 最低量的水，使其均质。水溶液用反相柱色谱法(采用去离子水洗脱)纯化。 用31PNMR监测流分，合并流分。经低压升华干燥后，获得相应的二钠盐(25 或30a-k)，为一浅黄色粉末。
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-(膦酰氧基二钠)-5-氯代苄酯 (25)
按照上述方法，经24(1.1g，1.7mmol)，得到浅黄色粉末25(0.4g，49％)：
1HNMR(300MHz，D2O)δ7.94(brs，2H)，7.72(s，1H)，7.2-7.0(m，3H)和 4.98(s，2H)。
13CNMR(75MHz，D2O)δ179.6，157.0，153.2，147.2(d)，145.2，136.8，131.4， 130.5，128.8，127.8，123.6和65.4.
31PNMR(121MHz，D2O)δ14.3.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-(膦酰氧基二钠)-5-氟代苄酯 (30a)
按照上述方法，由29a(10.5g，16mmol)得到7(6.2g，86％)，经NaHCO3处理得到浅黄色粉末30a(4.0g，59％)：
1HNMR(300MHz，D2O)δ8.2(brs，1H)，7.8(brm，1H)，7.57(brs，1H)， 7.15(m，1H)，6.93(m，1H)，6.81(m，1H)，6.78(m，1H)和4.93(s，2H)。
13CNMR(75MHz，D2O)δ179.4，161.5，158.4，156.5，150.3，147.3，146.5， 136.7，130.8，130.4，127.7，123.5，117.5，117.2和65.2.
31PNMR(121MHz，D2O)δ14.5.
19FNMR(282MHz，D2O)δ-57.4.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-(膦酰氧基二钠)-5)-硝基苄 酯(30b)
按照上述方法，经29b(2.1g，3.0mmol)，得到暗黄色粉末30b(1.0g，73％)：
1HNMR(300MHz，D2O)δ8.0-7.8(m，4H)，7.40(m，1H)，7.17(m，1H)和 5.06(s，2H)。
31PNMR(121MHz，D2O)δ13.8.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-(膦酰氧基二钠)-5-(甲氧基 苄酯(30c)
按照上述方法，经29c(4.3g，16mmol)，得到9(2.9g，98％)，经NHCO3处理得到30c(1.6g，43％)浅黄色粉末：
1HNMR(300MHz，D2O)δ7.96(brs，1H)，7.70(brs，1H)，7.21(brs，1H)， 7.08(brs，1H)，6.73(s，2H)，5.05(s，2H)和3.65(s，3H)。
13CNMR(75MHz，D2O)δ174.5，151.8，151.1，143.4，142.1，141.7，135. 9，131.6，126.4，124.9，122.6，118.4，111.7，60.8和53.2.
31PNMR(121MHz，D2O)δ14.6.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-(膦酰氧基二钠)-5-三氟甲氧 基苄酯(30d)
按照上述方法，经29d(1.9g，2.6mmol)，得到浅黄色粉末30d(0.5g，31％)：
1HNMR(300MHz，D2O)δ7.93(brs，1H)，7.86(brd，1H)，7.71(s，1H)， 7.25(d，1H)，7.02(m，4H)和5.01(s，2H)。
13CNMR(75MHz，D2O)δ179.5，173.5，157.1，153.3，147.1，146.8，145.5， 141.2(m)，136.5，132.4(m)，130.2(d)，127.7(d)，124.5，124.0，123.1，122.6，121.0- 65.4.
31PNMR(121MHz，D2O)δ14.3.
19FNMR(282MHz，D2O)δ-56.3.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-(膦酰氧基二钠)-5-三氟甲基 苄酯(30e)
按照上述方法，经29e(3.6g，5.2mmol)，得到浅黄色粉末30e(1.3g，45％)：
1HNMR(300MHz，D2O)δ7.98(brs，1H)，7.89(d，1H)，7.77(s，1H)，7.4- 7.3(m，3H)，7.08(m，1H)和5.04(s，2H)。
31pNMR(121MHz，D2O)δ14.0.
19FNMR(282MHz，D2O)δ-59.4.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-(膦酰氧基二钠)-3，5-二氯代 苄酯(30f)
按照上述方法，经29f(4.5g，6.5mmol)，得到浅黄色粉末30f(0.8g，24％)：
1HNMR(300MHz，D2O)δ8.31(brs，1H)，7.88(brd，2H)，7.6-7.5(m，2H)， 7.2-6.8(m，5H)和5.07(s，2H)。
13CNMR(75MHz，D2O)δ179.6，156.6(d)，149.4(d)，147.4，146.8(d)，136.6， 134.2，131.5，131.1，130.7(d)，130.1，128.5，127.7(d)和65.6.
31PNMR(121MHz，D2O)δ14.4.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-(膦酰氧基二钠)-4，5-二氯代 苄酯(30g)
按照上述方法，经29g(2.5g，3.0mmol)，得到浅黄色粉末30g(0.4g，23％)：
1HNMR(300MHz，D2O)δ8.07(s，1H)，7.99(m，1H)，7.85(s，1H)，7.39(s， 1H)，7.19(m，2H)和4.99(s，2H)。
31pNMR(121MHz，D2O)δ14.3.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-(膦酰氧基二钠)-5，6-二氯代 苄酯(30h)
按照上述方法，经29h(4.6g，6.6mmol)，得到浅黄色粉末30h(2.3g，64％)：
1HNMR(300MHz，D2O)δ8.01(s，1H)，7.91(brs，1H)，7.73(s，1H)，7.23(dd， 2H)，7.12(m，1H)和5.18(s，2H)。
31PNMR(121MHz，D2O)δ14.2.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-(膦酰氧基二钠)-3-甲基苄酯 (30i)
按照上述方法，经29i(1.2g，1.8mmol)，得到黄色粉末30i(0.5g，57％)：
1HNMR(300MHz，D2O)δ8.11(brs，2H)，7.91(m，2H)，7.71(m，1H)， 7.00(m，2H)，6.84(m，1H)，5.22(s，2H)和2.14(s，3H)。
13CNMR(75MHz，D2O)δ146.1，134.6，133.6，131.1，128.8，127.9，125.7， 66.6和19.1.
31PNMR(121MHz，D20)δ14.2.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-(膦酰氧基二钠)-4-氯代苄酯 (30j)
按照上述步骤，经29j(4.2g，6.6mmol)，得到浅黄色粉末30j(1.6g，48％)：
1HNMR(300MHz，D2O)δ7.98(s，1H)，7.90(m，1H)，7.74(s，1H)，7.31(s， 1H)，7.09(m，3H)，6.85(m，1H)和5.00(s，2H)。
13CNMR(75MHz，D2O)δ180.0，157.7，155.9，147.6，147.4，142.3，137.1， 136.8，133.2，132.9，128.3，127.9，124.9和65.9.
31PNMR(121MHz，D2O)δ14.3.
(2-醛缩氨基硫脲甲基吡啶-3-基)氨基甲酸2-(膦酰氧基二钠)-4-甲氧基苄 酯(30k)
按照上述步骤，经29k(2.9g，4.4mmol)，得到淡黄色粉末30k(1.2g，54％)：
1HNMR(300MHz，D2O)δ8.06(s，1H)，7.94(s，1H)，7.64(s，1H)，7.13(m， 1H)，7.0-6.8(m，3H)，6.43(m，1H)，4.06(s，2H)和3.58(s，3H)。
13CNMR(75MHz，D2O)δ161.5，161.3，155.1，133.1，127.3，127.0，111.4， 108.3和57.9.
31PNMR(121MHz，D2O)δ14.3.
生物检验/数据
前药经碱性磷酸酶催化生物转化为3-AP
采用4.65×10-5单位的磷酸酶酶溶液(VII-SA型，来自BovineIntestinal Mucose，Sigma公司)，研究了二甲基对位前药和磷酸盐前药亚型的生物活 化。在与磷酸酶保温的过程中，所有前药均转化为母体药物3-AP。在此实 验条件之下，对邻位磷酸盐前药进行的生物活化并未提高其半衰期(T/2)(与 未取代的邻位前药相比)(下表1)。将前药置于人血清中37℃保温，进行其 人血清稳定性研究。该研究表明，4-氯代磷酸盐前药16是一种缓慢释放的 前药，其半衰期是邻位前药的1.5倍。
表1：3-AP磷酸盐前药的酶促生物转化和血清稳定性 半衰期 前药 碱性磷酸酶37℃ 人血清37℃ 缓冲盐水pH7.6，37℃ 邻位-(2) 16.3min 2.7hr 未水解 对位-(3) 9.2min 1.2hr 5.5hr 5-Cl-(6) 30.5min 3.4hr 162hr 5-F-(7) 未测试 3.8hr 未水解 5-CH3O(9) 22.1min 3.2hr 151hr 4-Cl-(16) 29.9min 4.0hr 未水解 4-CH3O(17) 未测试 13.3hr 15.7hr
对含邻位磷酸盐3-AP前药的体内PK研究
向Beagle静脉内犬施用单一剂量为7.2-8.5mg/kg的3-AP磷酸盐前药(相 当于3mg/kg的3-AP)，以表征3-AP前药的药动学特征。每一前药每周施 用一次。每一剂量后，在施用下一剂量之前，要维持至少6天的洗净期 (washoutperiod)。用HPLC测定3-AP(Triapine)和前药在血清中的浓度，由 此计算各种的PK参数。将这些PK参数与来自另一独立研究的3-AP(等克 分子剂量)参数比较。采用隔室和非隔室模型，分析随时间变化的平均血药 浓度数据。计算3-AP和前药的AUC、总体清除率(Cl)、稳态分布容积(Vdss)、 终期半衰期(T1/2)Cmax和Tmax。
等克分子剂量前药的药动学参数如下表2所示。当体外与碱性磷酸酶 保温时，邻位磷酸盐前药表现为过早地快速生物转化成3-AP。然而，这种 转化在体内却相当迟缓，这表明碱性磷酸酶体内对药物的作用(off-rate)被延 迟。始终未检验到中间体酚(即预期的分裂产物)。与3-AP在犬中的半衰期(约 1.5小时)相比，部分邻位前药的血清半衰期相对延长，这相当于 TriapineTM(3-AP)在人体内的半衰期。4-氯代(16)、5-甲氧基(9)和5-氟代(7) 类似物的AUCs和半衰期也预示这一点。
表2：含邻位磷酸盐3-AP前药在犬体内的PK值 前药 Cmax (μg/mL) AUC (μg·min/L) T1/2 Cl (mL/min/kg) Vss (L/kg) 邻位-(3) 125 63309 5.9hr 0.11 0.14 5-Cl-(6) 136 24263 2.1hr 0.32 0.08 139 27939 2.3hr 0.28 0.09 5-F-(7) 114 44829 4.5hr 0.47 0.11 5-NO2-(8) 126 3396 19min 2.33 0.12 5-CH3O-(9) 126 51460 4.7hr 0.15 0.12 5-CF3O-(10) 144 17584 1.4hr 0.48 0.09 5-CF3-(11) 156 9579 43min 0.86 0.08 3，5-二-Cl-(12) 140 6939 34min 1.2 0.08 4，5-二-Cl-(13) 220 21499 1.1hr 0.39 0.15 5，6-二-Cl-(14) 202 34211 2.0hr 0.24 0.12 3-CH3-(15) 147 66756 5.3hr 0.11 0.08 4-Cl-(16) 120 46321 4.5hr 0.17 0.10
经i.V.施用等克分子剂量前药后3-AP的药动学参数如下表3所示。研 究结果证实，前药邻位(3)、5-氟代(7)和4-氯代(16)延长了母体3-AP的释放， 这使3-AP在血清的持续浓度相当于研究中的另一前药。这些化合物在水溶 液中表现出提高的稳定性。
表3：3-AP在犬体内的PK值 前药 Cmax (μg/mL) AUC (μg·min/L) Tmax (min) T1/2 (hour) V/F (L/kg) 对位-(2) 1.6 74.5 --- 1.5 2.80 邻位-(3) 0.6 698 8.6 14.2 1.77 5-Cl-(6) 2.2 456 16.7 2.2 0.42 2.1 395 --- 2.5 3.67 5-F-(7) 0.5 619 1.2 13.2 1.85 5-NO2-(8) 1.9 84 --- 0.5 4.27 5-CH3O-(9) 1.5 987 7.9 7.7 0.67 5-CF3O-(10) 9.2 709 --- 0.9 0.92 5-CF3-(11) 3.0 280 --- 1.1 2.74 3，4-二-Cl-(12) 2.1 163 --- 0.9 3.99 4，5-二-Cl-(13) 2.7 392 --- 1.7 3.14 5，6-二-Cl-(14) 3.6 1.6 2.32 3-CH3-(15) 1.5 998 7.8 7.8 5.18 4-Cl-(16) 0.8 888 9.0 12.4 1.21
最初，对均为7.5-7.7mg/kg(相当于3mg/kg的Triapine)的单一剂量的两 种前药进行研究。在该结果的基础上，又对5-氟代-前药(20、40和80mg/kg) 和4-氯代前药(20和30mg/kg)进行了提高剂量的药动学和毒物动力学研究。
Triapine和前药的PK参数见表4和5，并与施用3mg/kgTriapine(相当 于约7.5mg/kg前药)的独立研究结果进行比较。与用Triapine处理的犬相比， 接受4-氯代和5-氟代前药(等克分子剂量)的犬表现出提高的Triapine接触时 间(以AUC表示)。逐步提高剂量的研究表明，Triapine的血药浓度峰值和 AUCs与前药剂量线性相关。
表4.Triapine磷酸盐前药在犬体内的比较药动学 前药 剂量 (mg/kg) Cmax (μg/mL) AUC (mg·min/L) Tmax (min) T1/2 (hour) V/F (L/kg) 5-氟代- (7) 7.5 0.5 619 1.2 13.2 1.85 20 6.8 490 --- 0.8 2.90 40 12.4 1153 --- 1.1 3.22 80 32.0 2713 --- 1.0 2.50 4-氯代- (16) 7.7 0.8 888 9.0 12.4 1.21 20 13.0 2592 --- 2.3 1.53 30 31.9 5905 --- 2.1 0.94 Triapine 3 2.3 124 --- 1.8 3.57
表5.Triapine磷酸盐前药在犬体内的比较药动学 前药 剂量 (mg/kg) Cmax (μg/mL) AUC (mg·min/L) T1/2 (hour) Cl (mL/min/kg) Vss (L/kg) 5-氟代- (7) 7.5 114 44829 4.5hr 0.47 0.11 20 299.6 35877 1.4hr 0.56 0.11 40 412.0 56679 1.6hr 0.35 0.07 80 377.4 43863 1.3hr 0.46 0.06 4-氯代- (16) 7.7 120 46321 4.5hr 0.17 0.10 20 464 63080 1.6hr 0.32 0.07 30 556 90291 1.9hr 0.33 0.15 Triapine 3 2.3 124 --- 1.8 3.57
另一方面，前药的血清浓度峰值和AUCs不与剂量呈线性相关，并且 在所研究的剂量似乎呈饱和状态。前药的血药浓度-时间曲线见附图4和5。 这些数据表明，在大于或等于20mg/kg的IV剂量水平时，两种前药均表现 出向母体Triapine的生物转化延长，1μM(0.2μg/ml)以上的水平可维持24 小时。持续的血清Triapine水平可能是由于较高的前药血清水平及其较低 的总体清除率。4-氯代前药的Triapine的药动学如附图6所示。在24小时 时可观察到较高的Triapine血液水平(＞1μM)，犬对该剂量水平的耐受性较 好。
临床观察：接受4-氯代-前药的犬，未出现早期死亡。记录犬的与处理 相关的临床观察。在第2和3天(第1天＝给药当天)，用20mg/kg处理的雄 性犬出现稀粪。在给药后1天，一只用40mg/kg处理雌性犬表现出呕吐、 腹泻、大便中有黄色粘液、活动降低和发绀(口呈灰色)。第2天未观察到上 述现象。在第2天，唯一的不利临床征象是没有大便。用30mg/kg处理的 雄性犬的临床征象与用40mg/kg处理的雌性犬相似。因此，确定4-氯代-前 药的MTD在30-40mg/kg之间。
接受5-氟代-前药的犬，未出现早期死亡。用20(雌性)和40mg/kg(雄性) 处理的犬未观察到不利征象。记录80mg/kg处理的雌性的治疗相关的临床 观察。该雌性犬在输注期间和输注后出现呕吐。另外，可观察到所述犬出 现失色(皮肤苍白)、腹泻和在大便中有黄色粘液。所有上述观察均发生于第 1天，第2天即恢复。基于这些结果，确定5-氯代-前药的MTD为80mg/kg。
值得注意的是，在MTDs水平(4-氯代前药为30mg/kg，和5-氟代前药 为80mg/kg)时，两种前药均达到了Triapine的血药水平峰值(约32μg/ml)， 这表明在犬中观察到的毒性是由于Triapine所致，而非前药本身所致。
体内抗肿瘤效力
采用M109鼠肺癌模型，在Balb/c小鼠中对十二(12)3-AP前药的效力 和毒性进行了评价。实验方法如下：8周龄雌性Balb/c小鼠(约20g)，于0 天在右侧肋皮下注射5×105/鼠M109鼠肺癌细胞。然后将小鼠随机分组，每 组包括8-10只小鼠。按照表6所示的时间表，于第3或5天开始处理。3- AP与TriapineTM制剂一起使用，其中所有3-AP前药溶解或混悬于无菌去离 子水中。小鼠的体重和肿瘤体积每周测量两次，直到对照组中的肿瘤坏死 或者对照组中的至少一个动物死亡为止。
所得结果见下表6。根据这些药物的稳定性药动学和活性，很明显的 是5-氟代和4-氯代类似物(分别为7和16)表现出作为抗癌剂的最大活性。 另外，5-三氟甲氧基衍生物(10)、4，5-二氯代衍生物(13)和5，6-二氯代衍生物 (14)也表现出出人意料优良的活性。
表6：在M109肺癌模型的活性 前药 剂量 (mpk，ip) 时间表 (天) 抑制 (％) 体重减轻 (％) 相对活力 3-AP(1A) 5.5(bid) 3-7，10-14 60 8.09 ＜CTX 邻位-(3) 48QD 5-9，12-16 70 12.6 ＜CTX 5-Cl-(6) 60QD 5-9，12-16 67 5.3 ＝CTX 5-Fl-(7) 60QD 5-9，12-16 75 4.7 ＝CTX 5-NO2-(8) 60QD 3-7，10-14，17-21 33 9.7 ＜＜CTX 5-CH3O-(9) 48QD 5-9，12-16 73 13.5 ND 5-CF3O-(10) 100QD 3-7，10-14，17-21 81 8.7 ＝CTX 5-CF3-(11) 100QD 3-7，10-14，17-21 77 9.1 ＜CTX 3，5-二-Cl-(12) 60QD 3-7，10-14，17-21 58 9.0 ＜CTX 4，5-二-Cl-(13) 60QD 3-7，10-14，17-21 57 10.0 ＜CTX 5，6-二-Cl-(14) 60QD 3-7，10-14，17-21 59 7.0 ＜CTX 3-CH3-(15) 60QD 3-7，10-14 64 7.9 ＜CTX 4-Cl-(16) 60QD 5-9，12-16 74 12.6 ＝CTX
CTX＝环磷酰胺
通常，可以高于3-AP的MTDs8倍(克分子水平)的剂量施用3-AP的 前药。这些药物也可按每1-5天/周(QD1-5)的方案持续施用一段时间，期间 小鼠未出现过高死亡率。与MTD水平的3-AP母体相比，用化合物3、6、 7、9、10-16处理M109肺癌取得了较好的效力。随后按照附图7c所示的 时间表，用前药7和16对M109肺癌进行了研究，结果表明它们可明显有 效地抗M109肺癌。在小鼠中，也就这些药物(前药7和16)对其它癌细胞系 例如HTB人肺癌、B16-F10黑素瘤、DLD-1结肠癌的作用进行了试验，结 果表明它们的效力显著高于环磷酰胺(参见图7D、E和F)。
对5-氯代(6)、5-氟代(7)和4-氯代(16)和类似物进行了进一步研究(例如 最适剂量和剂量方案、不同的给药途径以及与化学疗法的联用)。这些实验 的结果见附图(附图4-10)。可很方便地由附图得出结果，这些结果表明本发 明前药可较好地与DNA损伤剂环磷酰胺和丝裂霉素C联用(附图8A-D和 9A-C)。同样地，本发明化合物也可与依托泊苷(图9D)和顺氯氨铂联用而更 有效地对抗人结肠癌和人Lovo结肠癌(附图10A和B)。
3-AP前药对Balb/c小鼠中M109肺癌的效力
材料：M109肺癌细胞；BALB/c小鼠(雌性，9周龄，18-20g)；环磷酰胺 (Sigma)；3-AP前药(邻位3-AP前药(3)，5-甲氧基3-AP前药(9)，5-氯代3-AP 前药(6)，4-氯3-AP前药(16)，5-氟3-AP前药(7)，和4-氟3-AP前药(12)。
110Balb/c鼠随机地分成12组：
组别：小鼠
1.载体，0.2ml，Qd(5-9天；12-16；19-23)10
2.200mpk环磷酰胺，I.P.，l/w10
3.48mpk邻位3-AP前药，I.P.，Qd(5-9天；12-16；19-23)10
4.60mpk邻位3-AP前药，I.P.，Qd(5-9天；12-16；19-23)10
5.48mpk5-甲氧基3-AP前药，I.P.，Qd(5-9天；12-16；19-23)10
6.55mpk5-甲氧基3-AP前药，I.P.，Qd(5-9天；12-16；19-23)10
7.48mpk5-氯3-AP前药，I.P.，Qd(5-9天；12-16；19-23)10
8.60mpk5-氯3-AP前药，I.P.，Qd(5-9天；12-16；19-23)10
9.48mpk4-氯3-AP前药，I.P.，Qd(5-9天；12-16；19-23)10
10.60mpk4-氯3-AP前药，I.P.，Qd(5-9天；12-16；19-23)10
11.48mpk5-氟3-AP前药，I.P.，Qd(5-9天；12-16；19-23)7
12.48mpk4-氟3-AP前药，I.P.，Qd(5-9天；12-16；19-23)8
(注：W/周；I.P./腹膜内注射；Qd/每天)
配制3-AP前药：在注射以前，将前药溶于去离子无菌水中，配制每种 3-AP前药的贮备液(10.0mg/ml)。用水进一步稀释3-AP前药贮备液，配制以 下每种前药。
试管贮备液水前药浓度体积
1.1.8ml1.2ml6.0mg/ml3ml
2.1.65ml1.35ml5.5mg/ml(甲氧基3-AP)3ml
3.1.44ml1.56ml4.8mg/ml3ml
经胰蛋白酶处理收集对数生长期的M109细胞，用PBS洗涤，重建成 2.5×106细胞/mlPBS。于0天，经于右侧肋皮下经植入M109悬浮液(0.2ml， 5×105细胞/鼠)。小鼠按上述随机再分组。按照上述时间表，于第5天开始药 物处理。小鼠置于干净的恒温实验室中。饲养铺垫至少每周换两次。为小鼠 提供充足的生物和饮用水。饮用水用前热压处理。由于对小鼠的严重毒性反 应或死亡，在实验结束前停止用邻位磷酸盐3-AP前药(3)和5-甲氧基3-AP 前药(9)处理。在实验结束之前每周两次测定体重和肿瘤。每日观察小鼠的死 亡率和外表。
附图7A、7B和7C表示5-氟3-AP前药(7)和4-氯3-AP前药(16)相对于 200mpk环磷酰胺的效力(与对照比较)。3-AP前药表现出相当于环磷酰胺的 优良的缩小肿瘤的效力，而没有出现死亡。
3-AP前药/环磷酰胺联合化学疗法对Balb/c小鼠M109肺癌的效力
材料：M109肺癌细胞；BALB/c小鼠(雌性，9周龄，19-21g)；环磷酰 胺(Sigma公司)；丝裂霉素C；5-氯3-AP前药(6)，和5-氟3-AP前药(7)。
120Balb/c小鼠随机地分成15组，每组包括8只小鼠。
组别：小鼠
1.载体0.2ml，Qd(3-7天；10-14)8
2.200mpk环磷酰胺，I.P.，1/W×3(于第3天开始)8
3.3mpk丝裂霉素C，I.V.，Qd(3和17天)8
4.45mpk5-氯3-AP前药，I.P./Qd(3-7天；10-14)+100mpk环磷8
酰胺，I.P.，1/W(于第4天开始)
5.45mpk5-氯3-AP前药，I.P./Qd(3-7天；10-14)+150mpk环磷8
酰胺，I.P.，1/W(开始于第4天)
6.45mpk5-氯3-AP前药，I.P./Qd(3-7天；10-14)+200mpk环磷8
酰胺，I.P.，1/W(开始于第4天)
7.60mpk5-氯3-AP前药，I.P./Qd(3-7天；10-14)+100mpk环磷8
酰胺，I.P.，1/W(开始于第4天)
8.60mpk5-氯3-AP前药，I.P./Qd(3-7天；10-14)+150mpk环磷8
酰胺，I.P.，1/W(开始于第4天)
9.60mpk5-氯3-AP前药，I.P./Qd(3-7天；10-14)+200mpk环磷8
酰胺，I.P.，1/W(开始于第4天)
10.45mpk5-氟3-AP前药，I.P./每日(3-7天；10-14)+100mpk环8
磷酰胺，I.P.，1/W(开始于第4天)
11.45mpk5-氟3-AP前药，I.P./Qd(3-7天；10-14)+150mpk环8
磷酰胺，I.P.，1/W(开始于第4天)
12.45mpk5-氟3-AP前药，I.P./Qd(3-7天；10-14)+200mpk环8
磷酰胺，I.P.，1/W(开始于第4天)
13.60mpk5-氟3-AP前药，I.P./Qd(3-7天；10-14)+100mpk环8
磷酰胺，I.P.，1/W(开始于第4天)
14.60mpk5-氟3-AP前药，I.P./Qd(3-7天；10-14)+150mpk环8
磷酰胺，I.P.，1/W(开始于第4天)
15.60mpk5-氟3-AP前药，I.P./Qd(3-7天；10-14)+200mpk环8
磷酰胺，I.P.，1/W(开始于第4天)
(注：I.V./静脉注射)
配制3-AP前药贮备液：在注射前，将前药溶于去离子无菌水中，配制 每种3-AP前药贮备液(10.0mg/ml)。3-AP前药贮备液用水稀释，配制以下 每种前药。
试管贮备液水前药浓度体积
1.1.8ml1.2ml6.0mg/ml3ml
2.1.35ml1.65ml4.5mg/ml3ml
经胰蛋白酶处理收集对数生长期的M109细胞，用PBS洗涤，重建成 2.5×106细胞/mlPBS。于0天，经于右侧肋皮下经植入M109悬浮液(0.2ml， 5×105细胞/鼠)。小鼠按上述随机再分组。按照上述时间表，于第3天开始 药物处理。小鼠置于干净的恒温实验室中。饲养铺垫至少每周换两次。为 小鼠提供充足的食物和饮用水。饮用水用前热压处理。在实验结束之前， 每周两次测定体重和肿瘤。每日观察小鼠的死亡率和外表。图7C是环磷酰 胺与前药(3)的另一比较试验。
附图7D-F表明在指定条件下，5-氟3-AP前药(7)和4-氯代前药(16)在 对抗小鼠HTB177人肺癌B16-F10黑素瘤和DLD-1结肠癌中表现出的活性。
图8A-D表明5-氯3-AP前药(6)和5氟3-AP前药(7)联用化学疗法化学 疗法(联用环磷酰胺)在对抗M109肺癌中表现出的相对于200mpk环磷酰胺 的效力(与对照比较)。与单独使用环磷酰胺相比，3-AP前药联用环磷酰胺 表现出优良的协同缩小肿瘤的效力。值得注意的是，在该实验期间没有动 物死亡。
以5-氟3-AP前药/环磷酰胺或丝裂霉素为基础的联用化学疗法对 Balb/C小鼠M109肺癌的效力
材料：M109肺癌细胞；BALB/c小鼠(雌性，9周龄，19-21g)；环磷酰胺 (Sigma公司)；丝裂霉素C和5-氟代邻位-3-AP前药(7)。
121Balb/c小鼠随机地分成12组，每组包括10只小鼠。
组别：小鼠
1.载体0.2ml，Qd(3-7天；10-14)11
2.200mpk环磷酰胺，I.P.，1/W×3(于第3天开始)10
3.3mpk丝裂霉素C，I.V.，QD(3和13天)10
4.45mpk5-氟3-AP前药，I.P./Qd(3-7天；10-14)+150mpk环磷10
酰胺，I.P.，1/W(开始于第4天)
5.45mpk5-氟3-AP前药，I.P./Qd(3-7天；10-14)+200mpk环磷10
酰胺，I.P.，1/W(开始于第4天)
6.60mpk5-氟3-AP前药，I.P./Qd(3-7天；10-14)+150mpk环磷10
酰胺，I.P.，1/W(开始于第4天)
7.60mpk5-氟3-AP前药，I.P./Qd(3-7天；10-14)+200mpk环磷10
酰胺，I.P.，1/W(开始于第4天)
8.45mpk5-氟3-AP前药，I.P./Qd(3-7天；10-14)+2mpk丝裂霉10
素C，I.V.，QD(天3和13)
9.60mpk5-氟3-Ap前药，I.P./Qd(3-7天；10-14)+2mpk丝裂霉10
素C，I.V.，QD(天3和13)
10.120mpk5-氟3-AP，S.C.Qd(3-7天)*10
11.150mpk5-氟3-AP，S.C.Qd(3-7天；10-14)**10
12.200mpk5-氟3-AP，S.C.Qd(3-6天)***10
(注：*由于小鼠的死亡，仅给予一个剂量方案；**给予两个剂量方案 后，由于体重降低而停止处理；***4天后因为小鼠死亡而停止处理；S.C./ 皮下注射)
配制3-AP前药：注射前，将前药溶于去离子无菌水中，配制5-氟3-AP 前药(7)贮备液(20.0mg/ml)。用水进一步稀释3-AP前药贮备液，配制以下每 种前药。
试管贮备液水前药浓度体积
1.3.0ml0ml20.0mg/ml3ml
2.2.25ml0.75ml15.0mg/ml3ml
3.1.8ml1.2ml12.0mg/ml3ml
4.1.5ml1.5ml10.0mg/ml3ml
2.0.9ml2.1ml6.0mg/ml3ml
2.0.68ml2.32ml4.5mg/ml3ml
将液氮中贮藏的M109肺和癌细胞(1×106细胞/ml×1ml)于37℃快速融 化解冻，并置于25mlDMEM培养基(含有10％FCS，37℃，在5％CO2中)。 传2代后，细胞用PBS(pH7.2)洗涤两次，胰蛋白酶化并再培养于含有50ml 培养基的烧瓶中。最后，经胰蛋白酶处理收集对数生长期的M109细胞(约 90-95％饱和)，用PBS洗涤，重建成5×106细胞/mlPBS，供肿瘤植入用。 于0天，经于右侧肋皮下经植入M109悬浮液(0.2ml，5×105细胞/鼠)。小鼠 按上述随机再分组。按照上述时间表，于第3天开始药物处理。小鼠置于 干净的恒温实验室中。饲养铺垫至少每周换两次。为小鼠提供充足的食物 和饮用水。饮用水用前热压处理。在实验结束之前，每周两次测定体重和 肿瘤。每日观察小鼠的死亡和外表。
附图9A-C表示5-氟3-AP前药(7)和5-氯3-AP前药(6)联用化学疗法(丝 裂霉素C)的相对于200mpk环磷酰胺的效力，以及与对照的比较。与单独 使用环磷酰胺或丝裂霉素C相比，3-AP前药与环磷酰胺和丝裂霉素的联用 表现出了有利的协同缩小肿瘤效力。附图D表示，5-氯3-AP前药(6)联用 依托泊苷与单独使用依托泊苷或对照的效力比较实验结果。该实验表明药 物联用均表现出协同抗M109肺癌的活性。
附图10A和10B表示4-氯3-AP(16)与顺铂联用抗DLD-1人结肠癌(图 10A)和人LoVo结肠癌(图10B)的效力。这两个实验中的联合治疗表明联合 治疗具有协同抗试验肿瘤的活性。
5-氟3-AP前药对C57BL/6J小鼠的LD50
材料：C57BL/6J小鼠(雌性，8周龄)；5-氟3-AP前药(7)。
55C57BL/6J小鼠随机分成11组，每组包括5只小鼠：
组别：小鼠
1.载体0.2ml灭菌去离子水，I.P.QD5
2.100mpk5-氟3-AP前药，I.P.Qd5
3.125mpk5-氟3-AP前药，I.P.Qd5
4.150mpk5-氟3-AP前药，I.P.Qd5
5.175mpk5-氟3-AP前药，I.P.Qd5
6.200mpk5-氟3-AP前药，I.P.Qd5
7.175mpk5-氟3-AP前药，S.C.Qd5
8.200mpk5-氟3-AP前药，S.C.Qd5
9.225mpk5-氟3-AP前药，S.C.Qd5
10.250mpk5-氟3-AP前药，S.C.Qd5
11.300mpk5-氟3-AP前药，S.C.Qd5
配制3-AP前药：将5-氟3-AP前药(7)溶于无菌无离子水中，配制贮备 液(30mg/ml)。3-AP前药贮备液进一步用水稀释，配制以下每种前药。
试管贮备液水前药浓度体积
1.3.0ml0ml30.0mg/ml3ml
2.2.5ml0.5ml25.0mg/ml3ml
3.2.25ml0.7522.5mg/ml3ml
4.2ml1ml20mg/ml3ml
5.1.75ml1.25ml17.5mg/ml3ml
6.1.5ml1.5ml15mg/ml3ml
7.1.25ml1.75ml12.5mg/ml3ml
8.1ml2ml10mg/ml3ml
按照上述时间表，于0天开始处理。每日记录动物的死亡情况。每周 两次测定体重，每日观察小鼠的外表和行为。图11表示测定5-氟AP前药 的LD50(约为160mpk)。
药动学研究
测定了3-AP(1A)邻位磷酸盐前药(2)、和5-F邻位磷酸盐前药(7，30a，图 3)在Beagle犬(Canisfamiliaris)中的药动学。
犬接受的剂量为：20mg/kg、30mg/kg和40mg/kg的3-AP和邻位磷酸 盐前药，和20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg的5-氟代邻位磷酸盐前药。根据 每种前药的最大耐受剂量分别确定每一化合物的给药方案，其中5-氟邻位 磷酸盐前药要高于3-AP或邻位磷酸盐前药(3)。(值得注意的是，即使80mg/kg 剂量的5-氟代邻位磷酸盐也没有对动物产生毒性，而30-40mg/kg水平的3- AP和邻位磷酸盐前药(3)即产生了毒性。)
按照附图12-15所示的间隔，测定动物体内的药物水平。这些附图表 明，邻位磷酸盐前药对3-AP的生物利用度有明显的影响，并且5-氟磷酸盐 前药可使3-AP持续保持明显更大的生物利用度和高浓度。3-AP和邻位磷 酸盐前药(3)的药动学数据见图12。
至于5-氟磷酸盐前药(7)，附图13-15所示数据表明5-氟磷酸盐衍生物 可提供前药化合物本身更大的生物利用度，以及更大的3-AP(前药降解所得) 生物利用度。另外。5-氟代磷酸盐前药的高水平3-AP持续时间(参见13)要 长于3-AP或邻位磷酸盐前药。
上述研究表明，高水平5-氟磷酸盐前药(7)的耐受性要优于3-AP或邻 位磷酸盐前药(3)，而且与邻位磷酸盐前药形式或3-AP药物本身相比，可传 递最初较高血药浓度的3-AP并维持更长时间。
本领域技术人员可以理解的是，前述说明和实施例对于本发明的实施 而言仅仅是示例性的，对本发明范畴并无任何限定。可针对在此详述的本 发明进行并不偏离以下权利要求定义的本发明范畴的改进和变化。
